​Nature 长文| 肠道类器官发育中如何打破对称性？

来源：BioArt

在相同条件下生长的细胞即便具有相似的遗传信息，其生长与分化的潜能也各不相同。这可能与基因表达的随机波动或者周围细胞的影响有关【1】。单个细胞能够感应“群体环境”，同时这些微环境造成的影响会反馈在这些细胞的生理状态和基因表达上。但是单个细胞是如何在群体细胞建立的过程中打破对称性从而形成正常的组织形态结构还知之甚少。

类器官作为能够体外培养具有3D结构并且能够高度概括干细胞的分化潜能等特征，而被认为是研究单细胞对称性破缺（Symmetry breaking）进行过程的极佳模型。近期发表在Nature Medicine上关于卵巢癌类器官的实验平台的介绍，更是将类器官在癌症研究以及药物筛选方面的研究推向了一个新的高峰（详见BioArt报道：Nat Med丨卵巢癌类器官平台：点亮卵巢癌研究）。而肠道类器官对于肠道细胞的模式建成以及肠道细胞种类的严格反映，也使得肠道类器官从各种体外培养的类器官中脱颖而出被广泛研究与使用【3】。

为了研究单细胞对称性破缺的分子机制，近日，来自于瑞士巴塞尔大学和Friedrich Miescher生物医学研究所的Prisca Liberali团队通过单细胞基因组学与成像联用的方式，在LGR5+以及LGR5-两种类器官中研究了肠道干细胞的形成过程以及对称性破缺中涉及的分子机制，该文章发表在Nature上，题为Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development。

首先，作者们建立了体外分选及单细胞培养LGR5+和LGR5-类器官的体系（图1）。在培养最初的三天会在培养基中添加WNT3A，而在随后的培养中会将外加的WNT3A去除。LGR5+肠道干细胞诱导类器官效率大约为18%，而LGR-的干细胞诱导类器官的效率大约是7.5%。两种类型的类器官发育过程比较相似，发育过程的最后都一般会存在两种形态，一种是对称性仍然存的肠囊肿形态（Enterocyst），另一种是对称性破缺的出芽型类器官（Budding organoid）能够逐渐发育出肠道上皮正常的结构（图2）。

图1 小鼠肠道干细胞单细胞类器官建立流程。

图2不同形态的肠道干细胞类器官类型。

出芽型类器官的形成存在对称性破缺的事件，同时由于也存在肠囊肿类型的类器官，两者之间的基因表达谱等方面的差别可能对于揭开细胞生长和分化过程中是如何打破对称性的给出一些线索，因此可以作为研究对称性破缺的重要工具。

通过对于不同生长时间的类器官进行RNA-seq发现，在LGR5-的类器官中会产生YAP1靶标基因的瞬时激活，这对类器官的发育过程非常重要。但是在此过程中，Yap1的mRNA的量并没有发生明显的变化，因此这给了作者们一个提示即YAP1发挥作用可能是通过转录后调控方式进行的。通过对于YAP1在类器官发育的不同时期的蛋白质定位以及丰度进行分析后发现，在细胞逐渐增多时YAP1的定位会从细胞核中转到细胞质中，从而在一些细胞中失去活性。值得注意的是YAP1在对称的肠囊肿中并不存在。通过敲除YAP1或者是外加YAP1抑制剂均能够显著的降低类器官诱导成功的效率，但YAP1的过度激活会大幅度增加肠囊肿产生的比例。这说明YAP1在对称性破缺的过程中的作用并不是由YAP1的绝对丰度决定而是由在单细胞之间不同的激活状态引起的。

为了进一步探究YAP1调控对称性破缺的分子机制，作者们通过单细胞RNA-seq对类器官中的细胞进行分析后发现，YAP1高表达与Notch信号通路中的很多基因比如DLL1表达具有一致性。DLL1表达出现伴随着YAP1在细胞核中高水平表达，并且之前也有研究表明DLL1是YAP1的靶标基因【4】。为了确认Notch-DLL1是否对对称性破缺具有重要作用，通过外源加入γ-分泌酶抑制剂后观察对于类器官对称性破缺的影响。明显地发现在加入γ-分泌酶抑制剂后，产生肠囊肿的比例大大升高。因此，细胞核中的YAP1对于起始Notch-DLL1的作用非常重要，这使得具有YAP1核内高表达的细胞变成DLL+细胞，并且随后产生具有对正常肠道分泌与结构形成非常重要的潘氏细胞，打破类器官中的对称性（图3）。

图3类器官发育过程及对称性破缺的模式图。

YAP1在很多组织中会作为组织损伤修复的“感应器”，同时，对于祖细胞特异性基因表达具有广泛的调控作用。此工作揭示了YAP1的核定位和活性对于多细胞如何打破对称性、建立正常的组织结构、自我组装的重要作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1146-y

制版人：半夏

参考文献

1. Eldar, A. & Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature 467, 167-173, doi:10.1038/nature09326 (2010).

2.Kopper, O. et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine, doi:10.1038/s41591-019-0422-6 (2019).

3.Snijder, B. & Pelkmans, L. Origins of regulated cell-to-cell variability. Nature reviews. Molecular cell biology 12, 119-125, doi:10.1038/nrm3044 (2011).

4.Gregorieff, A., Liu, Y., Inanlou, M. R., Khomchuk, Y. & Wrana, J. L. Yap-dependent reprogramming of Lgr5(+) stem cells drives intestinal regeneration and cancer. Nature 526, 715-718, doi:10.1038/nature15382 (2015).