杨辉/郭帆/李亦学等开发更高精度的单碱基基因编辑工具，全面降低RNA脱靶风险

来源：BioArt

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单碱基编辑技术是自2012年CRISPR/Cas9技术问世以来最被寄予厚望的高精度基因编辑技术，由于单碱基基因编辑器不引入DNA断裂，过去一直被认为比传统方法更加高效而安全，成为脊髓性肌营养不良、地中海贫血、血友病、视网膜黄斑变性、遗传性耳聋等罕见病基因治疗的热门工具之一。今年三月份，中科院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉团队与中科院遗传所高彩霞团队“背靠背”在Science杂志报道单碱基编辑技术BE3存在全基因组范围内的DNA脱靶效应（详见BioArt报道：专家热评Science丨杨辉组/高彩霞组“背靠背”首次发现单碱基编辑系统存在严重脱靶效应），促使了人们对单碱基编辑工具的安全性的重新审视。既然单碱基编辑器在基因组上可以造成大范围脱靶效应，那么在RNA水平是否存在脱靶效应呢？杨辉团队及其合作者郭帆团队、李亦学团队研究发现，不仅BE3系统存在大量的RNA脱靶，之前被认为在基因组水平不产生脱靶的ABE系统也存在RNA脱靶，更为重要的是，研究人员对多种热门的存在脱靶风险的单碱基基因编辑工作进行了改造，最终获得了更高精度的单碱基基因编辑工具，为推动单碱基基因编辑技术进入临床治疗提供了重要的基础。相关工作于北京时间2019年6月11日凌晨在线发表在Nature杂志上。鉴于上述工作的重要意义，BioArt特别邀请到了北京大学魏文胜教授进行点评，以飨读者！

点评 | 魏文胜（北京大学）

基于CRISPR/Cas9的DNA单碱基编辑技术可以在不切断DNA双链的情况下实现靶向的核苷酸定向突变，在2016年首次在Nature杂志上报道以来受到了广泛的关注，该技术在未来的遗传病治疗中被寄予厚望【1】。后续的多篇研究证明了单碱基编辑系统在小鼠和人的胚胎中具有非常高的编辑效率【2,3】，同时多篇发表在Nature Medicine的文章证明DNA单碱基编辑技术还可以应用到小鼠的成体治疗中，获得喜人的治疗效果【4,5】。

2019年4月17日，美国麻省总医院的Keith Joung团队在Nature上发表了题为Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors的文章【6】，报道了BE3和ABE这两种重要的DNA单碱基编辑器均曾在大量的RNA脱靶，并且利用点突变的方法筛选到一个BE3的突变体可以降低RNA的脱靶。紧接着在5月8日，David Liu团队的在Science Advances杂志报道了题为Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors的研究【7】，该文章中报道了一种ABE的突变体ABEmaxAW能够降低RNA的脱靶数量，同时保持DNA的编辑活性，但是值得注意的是，该突变体并未将RNA脱靶降低至对照组的水平，同时DNA的编辑的效率也有所下降。Keith Joung组最近投在BioRxiv上的文章也指出【8】，将rAPOBEC1替换成单链DNA脱氨酶AID而不需要做任何的点突，就可以避免在RNA水平上的脱靶。目前对优化的CBE系统的on-target检测，数量还偏少，需要今后进一步增加样本量来验证其普适性。  

2019年6月10日，中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组、四川大学华西二院/生命科学学院郭帆研究组和中国科学院上海营养与健康研究所隶属于的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学研究所）李亦学研究组合作在Nature杂志在线发表了题为Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis的研究论文。

该研究发现DNA单碱基编辑工具CBE和ABE均存在大量的RNA脱靶效应，相比于仅有GFP处理的对照组，CBE或ABE处理的细胞的RNA SNV平均增加了15倍之多。研究者通过一系列分析证明这些RNA脱靶产生的单核苷酸突变与目的编辑位点没有序列相似性，而主要是由于DNA单碱基编辑器的脱氨酶APOBEC1 (BE3)和TadA (ABE)所导致的。此外，团队还发现很高比例的RNA脱靶发生在癌基因和抑癌基因上，如果用于临床治疗有较大的致癌风险。结合杨辉团队等今年3月在Science杂志报道单碱基编辑技术BE3存在全基因组范围内的DNA脱靶效应【9】（详见BioArt报道：专家热评Science丨杨辉组/高彩霞组“背靠背”首次发现单碱基编辑系统存在严重脱靶效应），该项研究发现了单碱基编辑工具还存在无法预测的RNA脱靶，加强了世人对单碱基编辑工具的安全性的审视。

为了获得更加精准的单碱基编辑工具，研究团队通过引入突变的方法对两种DNA单碱基编辑器的胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶分别进行了优化，最终获得了3种高保真度的BE3突变体，均能够完全消除RNA脱靶并维持DNA编辑活性的高精度单碱基编辑工具。针对ABE系统，杨辉等也是根据降低脱氨酶TadA*的RNA结合活性的思路进行点突，在降低RNA脱靶现象的同时维持了其在DNA上的编辑活性。此外，杨辉团队开发的ABE（F148A）突变体还能够缩小编辑窗口，实现更加精准的DNA编辑。该技术在特异性和精确性上超越了ABE7.10，结合之前的研究ABE并不造成DNA上的脱靶，该突变体有望在未来成为一种更加安全、更加精准的基因编辑工具，应用于临床治疗中。

Keith Joung组在BioRxiv上的文章中，则是尝试去掉野生型TadA，只保留进化而来的TadA*单体，并且对TadA*单体进行基于结构的点突，找到了几种突变TadA*单体，也可以达到类似的理想效果。

BioArt从杨辉团队了解到，该工作在评审过程中，审稿人给出了高度评价，评审专家认为：

“这是该领域的重要发现，并且突变体提供了有用的解决方案。 实验做得很好，结果令人信服（Overall, this is an important finding for the field, and the variants provide a useful solution. The experiments are well done and the results are convincing.）”；

“总的来说，这是一项做得很好的研究，并有适当的对照控制。提供了减少的RNA脱靶的单碱基编辑器，对基因编辑领域具有重要价值（Overall, this is a well-done study with proper controls. The resulting constructs that offer reduced off-target RNA editing will be of great value to the genome editing field）”。

据悉，该工作从实验设计到全部完成历时约半年左右，研究团队骨干成员基本上放弃了春节休假的时间精诚合作，最后高效的完成了任务，尽管该工作在线之前有国外同行稍早前在Nature和Science Advances杂志上发表了类似研究工作，但是因为该工作出色的实验设计与实验结果，该成果最终还是发表在Nature杂志上。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心博士研究生周昌阳、计算生物学所博士研究生孙怡迪、四川大学生命科学学院学生燕蕊、上海科技大学生命学院博士研究生刘亚京、中国农业科学院深圳农业基因组研究所研究员左二伟为论文共同第一作者，杨辉研究员、郭帆教授、杨辉课题组周海波博士以及李亦学研究员本文共同通讯作者。

部分论文主要作者。后排左起分别为共同第一作者刘亚京、孙怡迪、周昌阳和左二伟，前排为通讯作者杨辉研究员（左）以及杨辉组博士后周海波（右）。中国科学院科技摄影联盟 谢震霖 摄

共同通讯作者郭帆教授（左）与杨辉研究员（右）。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1314-0

专家点评

魏文胜（北京大学生命科学学院，研究员，致力于发展基因组编辑技术、功能基因组学以及基因治疗）

单碱基编辑技术因为不造成DNA双链断裂，被认为是相对安全的。今年二月份，高彩霞、杨辉及合作课题组分别报道C•G 到 T•A 碱基替换的胞嘧啶碱基编辑器BE3 (Base Editor 3, 利用胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1) 会产生sgRNA序列非依赖性脱靶现象。最近Keith Joung团队在Nature杂志上也报道BE3与ABE两种DNA单碱基编辑系统由于外源脱氨酶的表达，会产生大量RNA水平上的脱靶；该文通过对BE3编辑器的脱氨酶进行点突，降低了在RNA上的脱靶，但会影响到其对DNA碱基的编辑效率。

Nature今日在线发表了由中科院神经科学研究所杨辉、周海波与四川大学郭帆和中科院上海营养所李亦学课题组合作完成的论文，也报道了BE3与ABE两种DNA单碱基编辑器在RNA水平上的脱靶现象，提出了对这两种系统的优化方案，有效降低了它们在RNA水平上的脱靶效应。和Keith Joung课题组在不久前的Nature报道一致，该论文针对BE3系统也将大鼠来源的rAPOBEC1更换为人源的hAPOBEC3A，并对其结合单链RNA的结构域进行点突变，取得了理想效果。相关突变在保留了对DNA单碱基编辑效率的同时有效降低了RNA水平的脱靶 – 优于Keith Joung课题组的结果。Keith Joung组最近投在BioRxiv上的另一篇文章指出，将rAPOBEC1替换成单链DNA脱氨酶AID而不需要做任何的突变，就可以避免在RNA水平上的脱靶。目前对优化的CBE系统的on-target检测，数量还偏少，需要今后进一步增加样本量来验证其普适性。  

针对ABE系统，杨辉等也是根据降低脱氨酶TadA*的RNA结合活性的思路进行点突，在降低RNA脱靶现象的同时维持了其在DNA水平上的编辑活性。Keith Joung组在BioRxiv上的文章中，则是尝试去掉野生型TadA，只保留进化而来的TadA*单体并对其进行基于结构的点突，也可以达到类似的理想效果。

值得注意的是，目前的各种优化方案均不能解决BE3单碱基编辑系统对基因组DNA上产生的sgRNA序列非依赖性脱靶，需要新的策略来解决这一问题。

参考文献

1. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4.

2. Liang P, Sun H, Sun Y, Zhang X, Xie X, Zhang J, Zhang Z, Chen Y, Ding C, Xiong Y, Ma W, Liu D, Huang J, Songyang Z. Effective gene editing by high-fidelity base editor 2 in mouse zygotes. Protein Cell. 2017 Aug;8(8):601-611.

3. Liang P, Ding C, Sun H, Xie X, Xu Y, Zhang X, Sun Y, Xiong Y, Ma W, Liu Y, Wang Y, Fang J, Liu D, Songyang Z, Zhou C, Huang J. Correction of β-thalassemia mutant by base editor in human embryos. Protein Cell. 2017 Nov;8(11):811-822.

4. Rossidis AC, Stratigis JD, Chadwick AC, Hartman HA, Ahn NJ, Li H, Singh K, Coons BE, Li L, Lv W, Zoltick PW, Alapati D, Zacharias W, Jain R, Morrisey EE, Musunuru K, Peranteau WH. In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes. Nature Medicine. 2018 Oct;24(10):1513-1518.

5. Villiger L, Grisch-Chan HM, Lindsay H, Ringnalda F, Pogliano CB, Allegri G, Fingerhut R, Häberle J, Matos J, Robinson MD, Thöny B, Schwank G. Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice. Nature Medicine. 2018 Oct;24(10):1519-1525.

6. Grünewald J, Zhou R, Garcia SP, Iyer S, Lareau CA, Aryee MJ, Joung JK. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 2019 May;569(7756):433-437.

7. Rees HA, Wilson C, Doman JL, Liu DR. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Science Advances. 2019 May 8;5(5):eaax5717.

8. Grünewald J, Zhou R, Iyer S, Lareau GA, Garcia SP, Aryee MJ, Joung JK. CRISPR adenine and cytosine base editors with reduced RNA off-target activities. BioRxiv. 2019 May. doi: https://doi.org/10.1101/631721.

9. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, Ying W, Sun H, Yuan L, Steinmetz LM, Li Y, Yang H. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 2019 Apr 19;364(6437):289-292.