DNA硫代磷酸酯的氧化应激新机制

来源：ACS美国化学会

本文中，作者系统地研究了含硫代磷酸酯（PT）修饰DNA的细菌对过氧亚硝基（PN）降解DNA的防御过程中发生的反应及其内在机理和动力学过程，建立了PT修饰在抵御外源活性氧（ROS）损伤DNA过程中的模型。

DNA硫代磷酸酯（PT）修饰是一种近年来被发现的新型复制后修饰（图1），在微生物中主要受dndABCDE基因簇的调控。先前研究中，PT修饰的可增强细菌对众多极端环境的耐受性，且具有对芬顿试剂、H2O2等氧化剂具有一定的抵御功能。但也有研究证实，含PT修饰DNA的细菌对次氯酸显示出了更高的敏感性。因此，深入研究DNA的PT修饰与不同ROS，特别是细菌引发的免疫响应中生成的ROS间存在哪些相互作用显得尤为重要。过氧亚硝基是一种免疫应答中由巨噬细胞产生的ROS，可诱导DNA的断裂和碱基突变，并进一步触发细胞死亡，但PT修饰的DNA通过何种机制抵御PN仍未被阐明。

图1. PT修饰DNA、小分子DEPT、过氧亚硝基PN及其前体SIN-1的化学结构。

本文中，作者首先研究了PT修饰在对细菌抵御外源PN引发的氧化应激中的功能。小分子SIN-1是一种可以在生理条件下缓慢释放PN的物质，因而被广泛用于研究PN引发的氧化应激。作者在构建得到含有和缺失PN修饰的大肠杆菌后，使用SIN-1对两种细菌分别进行处理，并考察了两种细菌的存活、生长状况（图2）。结果表明，相比PT缺失的大肠杆菌，含有PT的大肠杆菌在使用SIN-1处理后有着更高的存活率，并仍具有一定生长繁殖的能力，说明了PT修饰在一定程度上可抵御PN引发的氧化应激。

图2. 细菌中PT修饰在抵御外源PN引发的氧化应激，维持存活及生长中的功能研究。A.含有及缺失PT修饰的大肠杆菌在使用SIN-1处理后的存活率及SIN-1对两种细菌的半致死量；B.两种大肠杆菌在含有不同浓度SIN-1培养基中的生长状况、速率。

为进一步探究上述现象的内在机制，作者首先分析了含PT修饰及不含PT修饰的质粒在胞外环境下与不同浓度SIN-1反应后的质粒形态（图3）。碘单质可以令DNA在PT修饰位点发生选择性断裂。因而在连续用SIN-1、碘单质处理质粒后，两种质粒在电泳中表现出了不同的状态。在高浓度的SIN-1中，两种质粒的电泳条带十分相似，表明此时质粒上的PT修饰可能已全部转化为正常的磷酯结构，无法被碘单质诱导断裂。但在低浓度的SIN-1中，两种质粒的电泳结果却存在显著性差异：含PT修饰的质粒在碘处理后会在多处发生断裂，而无PT修饰的质粒仅仅会从超螺旋转变为环状。基于上述结果，作者认为胞外条件下的PN氧化应激会诱导DNA上的PT修饰位点转变为普通的磷酰酯。

图3. 对含PT修饰及不含PT修饰的质粒在SIN-1处理后使用碘诱导PT位点断裂。A.琼脂糖凝胶电泳表征产物DNA；B.SIN-1处理及碘诱导后DNA可能的断裂情况。

随后，作者对上述转变过程中可能生成的产物进行了表征（图4）。在通过质谱分析16种含PT修饰的二核苷酸与PN反应产物后，作者发现不同的二核苷酸与PN反应的能力具有一定差异性，但都能够在反应后转变为普通磷酰酯。而小分子水平，作者发现DEPT与SIN-1的反应产物中存在SO42-、S8，因而作者推测含PT修饰的DNA与PN反应后的产物中可能也存在SO42-和S8，但并未进一步通过实验证明上述推测。

图4. 含PT修饰DNA与PN反应后的产物推测与表征。A.16种含PT修饰的二核苷酸与PN反应后的质谱数据分析；B.气相色谱比对分析反应产物；C.S8分子质谱谱图；D.离子色谱比对分析反应产物。

最后，作者还对该反应的动力学过程进行了研究。通过比较DEPT、谷胱甘肽以及不同种含有PT修饰的二核苷酸与PN的反应速率，作者发现相比于DEPT，二核苷酸与PN的反应速率会显著提高，接近谷胱甘肽等含有活性巯基的小分子。

总而言之，本文建立了一种细菌内PT修饰的DNA在抵御外源PN等引发的氧化应激过程中的防御机制模型（图5），并表征了其具体的反应过程、产物及动力学。证明了PT修饰可通过转化为普通磷酸酯，同时生成高价硫氧化产物的方式，减弱氧化应激过程中对DNA的损伤。这一机制有望于为研究新型抗菌药物，以及探索PT修饰的更多生物学功能提供全新的思路。

图5. 人类免疫系统中含PT修饰DNA的抗氧化机制