今天为大家带来一篇动脉粥样硬化领域的文章，其发表于nature communications。当年的影响因子为11.5。一篇动脉粥样硬化类的文章是怎么做到十分以上的呢？好奇的话咱们就来看看呗。

血小板衍生生长因子（PDGF）是血管平滑肌细胞（VSMC）的促分裂原和化学引诱物。但是，PDGF受体β（PDGFRβ）激活对VSMC的直接作用尚未在动脉粥样硬化的背景下进行研究。在本文中，作者研究发现，VMSC中的PDGFRβ-STAT1信号转导在主动脉外膜和介质中产生炎症环境，其强烈驱使动脉与高胆固醇血症协同形成动脉粥样硬化斑块。

1. PDGF信号传导诱导VSMC产生趋化因子

首先，作者建立了PDGFRβ激活突变体小鼠（PDGFRβ^D849V小鼠)(Fig1-a)。并使用该突变体及其对照建立了原代VSMC培养物，qRT-PCR结果显示，调节单核细胞和T细胞募集的趋化因子的mRNA水平上调(Fig1-b)。

作者还检测到来自突变体VSMC的趋化因子(Fig1-c)及血浆中的趋化因子表达水平均增加(Fig1-d)。

此外，通过用PDGF重组蛋白处理对照VSMC可以诱导趋化因子表达(Fig1-e)。总而言之，VMSCs中的PDGFRβ信号传导诱导几种趋化因子的表达，其中许多已知参与动脉粥样硬化。

2. VSMC中的PDGF信号传导引起主动脉炎症

于趋化因子分泌增加的发现，作者评估了主动脉壁中的白细胞群。流式细胞分析证明PDGFRβ^D849V突变体携带的CD45 ⁺白细胞总数增加了7倍(Fig2-a b)。大多数白细胞存在于外膜中，这是小群白细胞存在于非动脉粥样硬化主动脉中的正常部位(Fig2-c)。组织学分析还提供了突变主动脉外膜和培养基中丰富的累积白细胞的证据(Fig2-d)。

进一步的流式细胞分析显示突变主动脉中表达炎症因子的白细胞数量显著增加(Fig2-e)。这些数据表明，VSMC中的PDGF信号可能诱导趋化因子增加，其在胸主动脉壁中产生了炎症环境。接下来，作者使用Crenolanib（一种酪氨酸激酶抑制剂）处理PDGFRβ^D849V小鼠，结果发现：与未处理的突变体相比，接受该药物的突变体中白细胞数量减少(Fig2-f g)。这些数据表明持续的PDGFRβ激活维持了炎症反应。

3. VSMC的组成型去分化

如先前文献所言，PDGFRβ^D849V小鼠具有组成型去分化的VSMC并且表现出VSMC增生(Fig3-a)，表征血管平滑肌正常功能的相关蛋白表达也降低(Fig3-b)，并且细胞外基质产生也增加(Fig3-c d)。类似的，细胞超微结构与表型转换一致，突变体VMSC中存在大量粗糙的内质网而不是收缩束(Fig3-e)。

4. PDGF信号传导放大动脉粥样硬化

作者的研究表明，血管炎症和VSMC去分化分别作为动脉粥样硬化的早期和晚期标志，它们导致PDGFRβ^D849V小鼠比正常小鼠更容易患动脉粥样硬化。然而，动脉粥样硬化最重要的危险因素是高胆固醇，而PDGFRβ^D849V小鼠与对照组相比具有正常的胆固醇和甘油三酯水平。因此，为了产生高胆固醇血症，作者将PDGFRβ^D849V小鼠回交到ApoE缺陷小鼠上，产生了同时具有PDGFRβ激活突变和ApoE缺陷的小鼠（ApoE-PDGFRβ小鼠）及其同窝对照。因此，血清脂质谱如预期的那样增加（表1）。

WD（Western diet）16周后，作者使用油红染色和主动脉根部斑块的横断面来分析动脉粥样硬化程度。两种方法均显示了ApoE-PDGFRβ小鼠的斑块形成的显著增加。(Fig4-a)。类似地，ApoE-PDGFRβ小鼠中主动脉根部的斑块更大，并具有明确的纤维帽覆盖和无细胞坏死核心(Fig4-b)。接下来，作者量化了WD不同时间点后的横截面斑块面积，结果显示，ApoE-PDGFRβ小鼠的斑块显著增大(Fig4-c)。

类似的，作者发现，与ApoE对照相比，ApoE-PDGFRβ小鼠在主动脉在胸主动脉中仍然形成独特的斑块，且在其他部位则形成较大的斑块(Fig4-d)。为了进一步验证作者的结论，作者通过杂交又得到了同时具有PDGFRβ激活突变和LDLR缺陷的小鼠（LDLR-PDGFRβ小鼠)及其同窝对照。WD16周后比较对照组和LDLR-PDGFRβ小鼠，作者再次发现了LDLR-PDGFRβ小鼠主动脉中动脉粥样硬化斑块面积显著增加(Fig4-e 、Fig4-f)。总之，来自两种小鼠模型的研究结果清楚地表明，在各种高胆固醇血症条件下，VSMC中增加的PDGF信号转导强烈地放大了动脉粥样硬化。

5.  斑块发展为纤维粥样瘤和出血

作者对ApoE-PDGFRβ小鼠的胸主动脉斑块进行了仔细的形态学评估，因为它们具有惊人的尺寸和不寻常的位置。在WD6周时，斑块开始在内膜内积聚泡沫细胞巨噬细胞(Fig5-a)。经过WD 8周后，作者观察到平滑肌细胞侵入富含泡沫细胞的斑块，此时开始形成纤维帽结构(Fig5-b 黑色箭头)。

在WD16周和24周时，斑块已到达纤维帽动脉粥样硬化阶段，表现出良好形成的富含胶原蛋白的纤维帽和大的坏死核心(Fig5-c d e)。 WD16周后出现的另一个特征是晚期纤维粥样斑块内的出血区域(Fig5-f)。穿过这些区域的横切面显示斑块中含有出血而没有纤维帽破裂的迹象(Fig5-g)。

普鲁士蓝染色显示出血部位的铁沉积(Fig5-h)。作者也在ApoE-PDGFRβ小鼠的晚期斑块中观察到PECAM +微血管(Fig5-i)。总之，这些数据表明ApoE-PDGFRβ小鼠很容易产生具有与人类相似的具有先进形态的斑块，而具有这些特征的斑块在标准ApoE和LDLR缺陷小鼠模型中极为罕见。

6.  冠状动脉粥样硬化

冠状动脉斑块在ApoE单突变小鼠中不典型，作者也在一些PDGFRβ^D849V小鼠中观察到冠状动脉粥样硬化。在70％（10只中的7只）的ApoE-PDGFRβ小鼠中，作者观察到这种情况，其喂食饲料10-12个月(Fig6-a b)。

类似的现象也出现在71％（5/7）的LDLR-PDGFRβ小鼠中,其用WD喂养16周(Fig6-c d)。并且，这些斑块中的一些似乎是纤维粥样瘤(Fig6-b)。

7. PDGF信号转导激活VSMC中的STAT1

确凿的证据显示PDGFRβ信号通路的激活直接加重了动脉粥样硬化斑块的发生，作者开始讨论机制部分。作者假设PDGF诱导的趋化因子分泌和血管壁的炎症是驱动斑块起始的过程。作者选择将STAT1作为促炎性PDGFRβ信号传导的潜在介质。首先，作者使用IFN-γ处理PDGFRβ^D849V与对照VSMC，并发现其在PDGFRβ^D849V  VSMC中促进了了STAT1磷酸化(Fig7-a)。进一步，作者用PDGF处理对照VSMC导致了STAT1磷酸化(Fig7-b)。

并且用PDGFR抑制剂处理PDGFRβ^D849VVSMC消除了STAT1磷酸化(Fig7-c d)，表明组成型STAT1磷酸化依赖于PDGF途径活性。

PDGFR抑制剂取消了IFN-γ对STAT1磷酸化的促进作用(Fig7-e f第四泳道)，表明该过程不需要PDGFRβ。PDGFRβ^D849VVSMC中的组成型磷酸化STAT1可以通过添加外源IFN-γ进一步磷酸化(Fig7-e f第七泳道)，表明PDGFRβ^D849V VSMC仍然能够感知IFN。

在IFN-γ信号级联反应中，活化的IFN受体募集JAK1和-2，随后磷酸化STAT1。以前的研究发现PDGFRβ与JAK1，JAK2和相关激酶Tyk2相关并使其磷酸化。为了在VSMC中探索该通路的相关机制，作者用JAK1/ 2选择性抑制剂Rux处理了对照或PDGFRβ^D849V  VSMC，如所预期的，Rux阻断了IFN-γ对STAT1磷酸化的促进作用（(Fig7-g h第四泳道)。有趣的是，Rux还阻断了用PDGF重组蛋白处理的对照VSMC和未刺激的PDGFRβ^D849V  VSMC中的STAT1磷酸化(Fig7-g h第六和第八泳道)。这表明了JAK1和JAK2是PDGF信号传导途径中STAT1磷酸化所必需的。总之，这些数据表明PDGF信号传导激活了VSMC中的STAT1磷酸化。

8. STAT1调节趋化因子的产生和炎症

接下来，作者用STAT1-siRNA转染PDGFRβ^D849V  VSMC，并发现其在蛋白水平上显著降低了STAT1的磷酸化(Fig8-a)。与对照siRNA相比，STAT1敲减的PDGFRβ^D849V  VSMC的qRT-PCR结果显示了多种趋化因子的mRNA表达降低(Fig8-b)。

接下来，作者获得了STAT1条件性敲除小鼠并将其与PDGFRβ^D849V  小鼠培育得到了缺乏STAT1的PDGFRβ^D849V双突变体小鼠（PDGFRβ^D849V  ，STAT1-KO），蛋白印迹实了其VSMC缺失了STAT1蛋白(Fig8-c)。然后作者比较了来自Wt，STAT1-KO单突变体，PDGFRβ^D849V单突变体和（PDGFRβ^D849V，STAT1-KO）双突变小鼠的VSMC中趋化因子的表达。与siRNA敲低一致，双突变体VSMC细胞具有显著降低的的趋化因子表达(Fig8-d)。因此，PDGF信号传导途径通过STAT1依赖性机制调节趋化因子表达。

接下来，作者进一步研究了STAT1缺失是否可以改变主动脉壁中PDGFRβ驱动的白细胞积聚。流式结果证明，双突变体主动脉中CD45 +白细胞积聚降至几乎野生型水平(Fig8-e)。有趣的是，虽然STAT1缺失阻止了炎症发生，但仍然导致VSMC分化标志物的下调(Fig8-f)且能观察到主动脉扩张的现象。因此，STAT1调节PDGFRβ下游的VSMC趋化因子产生和主动脉炎症，但其对VSMC的去分化是不必要的。

9. PDGF / STAT1调节的炎症放大动脉粥样硬化

在Fig8中，作者的研究表明：ApoE，PDGFRβ^D849V小鼠中的STAT1缺失将是评估炎症与VSMC去分化作为促动脉粥样硬化机制的重要性的方法。为了测试这一点，作者产生了具有高胆固醇血症的（ApoE，PDGFRβ^D849V）单条件突变体和（ApoE，STAT1-KO，PDGFRβ^D849V）双条件突变体。WD 12周后，作者检查了动脉粥样硬化。与单条件突变体相比，双条件突变体的主动脉斑块小得多，并且双条件突变体在VSMC中缺乏STAT1(Fig9-a b)。此外，双条件突变体的主动脉根部的斑块明显小于单条件突变体的斑块(Fig9-c d)。

进一步的，在WD12周后,与单条件突变体相比，双条件突变体中斑块较小且不发达，具有发育不良的纤维帽和小的坏死核心(Fig9-e)。

因此，作者得出结论，VMSC中的PDGFRβ-STAT1信号转导在主动脉外膜和介质中产生炎性环境，其强烈促使动脉与高胆固醇血症协同形成动脉粥样硬化斑块。

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