Cell 重要应用丨全新一代多彩钙指示剂，带你窥视奇妙神经元活动

来源：BioArt

撰文 | 王小果

大脑复杂的行为学基础为神经元的功能活动及其相互联系。神经元的活动与其内部的钙离子浓度密切相关，神经元在放电的时候会爆发出一个短暂的钙离子浓度高峰，利用这种特定对应的相关关系，将神经元当中的钙离子浓度通过荧光强度表现出来，从而达到检测神经元活动的目的。目前基因编码的钙离子指示剂（GECIs）成为应用最为广泛的钙离子检测工具之一。GECIs主要是由绿色荧光蛋白（GFP）及其变异体荧光蛋白质，与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域融合而成【1】。尽管目前钙指示剂不断地得到改进、优化，但是仍然存在时间分辨率低（无法捕捉到神经元的快速放电活动）、颜色单一（只有绿色和红色）、动力学低等问题。

2019年5月9日，日本东京大学 (University of Tokyo) 的Haruhiko Bito教授课题组开发出全新一代多彩钙指示剂（蓝色、红色、绿色、橙色）可实现同时追踪多种不同神经元类型的活动，文章以article形式Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics发表在Cell杂志上【2】。

大多数钙离子指示剂基于钙调蛋白（CaM）构建，但是CaM蛋白对于钙离子的响应线性程度较差。因此2015年 Haruhiko Bito教授研究团队在Nature Methods采用CaMKK (一种激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶的激酶）的突变ckkap序列代替肌球蛋白轻链激酶M13域，并将红色荧光蛋白和CaMKK钙结合骨架蛋白进行融合开发出了动力学快、对钙离子高响应的红色钙离子探针RCaMP2【3】。本文基于RCaMP2构建原理，通过对GCaMP3、GCaMP5G、GCaMP6f、GCaMP6s和 G-CaMP4.1进行突变筛选，得到四种不同颜色的、对钙离子具有良好线性响应和快速反应动力学的钙离子探针XCaMP：分别为蓝色的XCaMP-B，绿色的XCaMP-G，橙色的XCaMP-O和红色的XCaMP-R。通过增加钙指示剂颜色的种类，可以实现在同一行为学下不同类型神经元的同时追踪，也可以结合光遗传学技术，可以研究特异性神经亚型和环路之间的关系。

XCaMP探针的功能强大之一，在于多色成像：研究团队利用XCaMP探针结合光纤记录系统实现对小鼠皮层中三种不同类型的神经元活动的动态追踪，发现新事物探索实验过程中这三种神经元的活动模式不同（图1），从而实现了自由活动状态下同时监测特定行为中三种不同神经元类型的活动。

图1. mPFC中不同神经元群体活动的三色成像

XCaMP探针的功能强大之二，在于微结构功能成像：目前缺乏对神经元突触前（轴突）和突触后（树突）同时双色成像的工具，只能对突触前或突触后结构进行单独功能成像，因此无法探究它们在时空分辨率上存在何种关系。利用彩色钙离子探针，研究人员结合双光子显微镜发现树突局部存在抑制作用（图2）。

图2. 彩色钙离子指示剂可标记不同神经元类型的树突和轴突结构

XCaMP探针的功能强大之三，在于深部脑成像：由于XCaMP探针荧光强度是RCaMP2的3倍左右，存在用于深部脑成像的潜能。因此研究人员利用红色的XCaMP-R对海马CA1区进行活体成像，可观察该脑区神经元活动（图3）。

图3. 海马CA1区活体XCaMP-R成像

总而言之，彩色钙指示剂可结合光纤记录系统、Miniscope技术、双光子显微镜、光遗传学技术可进一步明确揭示神经元之间的相互作用，它的开发以及应用为神经科学研究带来新的机遇。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.007

制版人：珂

参考文献

1．Gunaydin, L.A., Grosenick, L., Finkelstein, J.C., Kauvar, I.V., Fenno, L.E., Adhikari, A., Lammel, S., Mirzabekov, J.J., Airan, R.D., Zalocusky, K.A., et al.(2014). Natural neural projection dynamics underlying social behavior. Cell，157, 1535–1551.

2．Masatoshi Inoue, Atsuya Takeuchi，Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics，Cell 177, 1–15

3.Inoue, M., Takeuchi, A., Horigane, S., Ohkura, M., Gengyo-Ando, K., Fujii, H.,Kamijo, S., Takemoto-Kimura, S., Kano, M., Nakai, J., et al. (2015). Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods12, 64–70