泛素连接酶WWP2以单泛素的方式促进RUNX2蛋白在成骨分化中的作用

来源：小张聊科研

原标题：泛素连接酶WWP2以单泛素的方式促进RUNX2蛋白在成骨分化中的作用，有望为骨质疏松症提供新的治疗靶点！

文章的题目是The E3 ubiquitin ligase WWP2 facilitates RUNX2 protein transactivation in a mono-ubiquitination manner during osteogenic differentiationE3，作者是复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系暨代谢分子医学教育部重点实验室甘肖箐课题组的师生，在这篇文章中作者发现泛素连接酶 WWP2 以单泛素的方式促进 RUNX2 蛋白在成骨分化过程中的转染。

研究背景：造血源性破骨细胞可以控制骨吸收，骨骼间充质成骨细胞促进骨矿物质沉积，这两个过程的不平衡会导致骨质疏松症。而间充质干细胞成骨分化促进NEDD 4家族E3泛素蛋白家族成员的WWP 2表达及核内积聚，在骨髓间充质干细胞和成骨细胞中敲除WWP 2基因导致成骨功能下降，矿物质沉积减少和成骨标记基因的下调。RUNX2（core binding factor alphal 1）是Runt家族转录因子的成员之一，它们含有共同的DNA结合runt结构域，能与核心结合因子β（core binding factor betaCbfb) 形成异二聚体。RUNX2在软骨形成、骨代谢相关疾病方面至关重要，它能诱导骨骼间充质细胞的分化，并使间充质细胞向成骨细胞方向分化，抑制脂肪细胞和软骨细胞分化。具有颅骨锁骨发育不全综合征的患者RUNX22发生突变，其表现为身材矮小、锁骨发育不全、多生牙和囱门不能闭合。实验发现敲出小鼠的RUNX2基因，小鼠软骨形成分化完全中断，说明其在软骨发育中的重要作用。免疫共沉淀结果显示WWP 2与RUNX 2相互作用，WWP 2通过可以促进runx 2的单泛素化，进而促进成骨分化。

接下来作者将HA标记的WWP 2蛋白截短突变体导入HEK293T细胞，并进行免疫荧光检测，发现无C2结构域、非保守区或WW结构域的全长WWP 2和截短的WWP 2蛋白具有相似的细胞质定位，而缺乏催化Hect结构域的WWP 2蛋白的在核内大量积累。这一结果表明在没有Hect结构域的情况下，WWP 2蛋白本身就能主动地转运到细胞核中。接下来实验通过构建RANT24N蛋白进一步证明了作者的猜想：Hect结构域的存在阻断了WWP 2蛋白的核定位信号(NLS)4，即C端Hect结构域对WWP2核转运有负调控的作用，它能抑制WWP 2进入细胞核。 

为了弄清WPP2究竟是对RUNX2的DNA结合域和转录激活域哪个结构域进行调节从而使其转录活性升高，芯片分析结果显示WWP 2没有增加RUNX2与具有DNA结合活性的辅因子CBFB的亲和力，即WWP 2不影响RUNX 2与DNA的结合，WWP 2不参与RUNX 2 DNA结合结构域的调控。

为了验证WPP2可以调控RUNX2的转录激活域，实验通过构建DBD- RUNX2，使用GAL 4报告基因进行检测，发现DBD- RUNX2的转录活性，受WPP2共同表达的刺激。这一结果表明WWP 2增强了RUNX 2的转录激活活性，而非DNA结合能力。

那么WWP 2是否参与了间充质干细胞成骨过程中RUNX 2泛素化呢？实验通过在HEK293T细胞中共同表达了RUNX 2和His泛素，发现泛素结合的RUNX 2蛋白被Ni-NTA柱拉下，Western blotting结果显示WWP 2共表达诱导RUNX 2泛素化。Ub-K0是一种变异的泛素，其中7个赖氨酸残基都被精氨酸残基取代，可以防止聚泛素链的形成，RUNX 2在Ub-K0表达细胞中的泛素化模式与野生型泛素表达细胞相似，说明WWP 2将RUNX 2单一泛素化。

最后作者找到了泛素化过程涉及多种氨基酸残基，发现Lys-202, Lys-225, and Lys-240在WWP2对RUNX2的泛素化过程中必不可少。

总结这篇文章，WWP 2以非蛋白水解、单泛素化的方式催化RUNX 2，促进成骨分化。在此过程中，C端Hect结构域对WWP2核转运有负调控的作用，抑制WWP 2进入细胞核，而WWP 2通过增强RUNX 2的转录激活活性进而调节成骨分化，氨基酸残疾Lys-202、Lys-225和Lys-240在此过程必不可少。