2019年3连发，中科院动物所周琪/李伟团队极大拓展了基因组编辑工具库

来源：iNature

精确基因组编辑是基因治疗中一个非常有前途的领域，特别是随着CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats-CRISPR-associated蛋白）系统的出现。到目前为止，已成功利用三种类型的CRISPR-Cas系统：II型Cas9，V-A型Cas12a和V-B型Cas12b以促进哺乳动物基因组编辑。2019年4月23日。中国科学院动物研究所周琪、李伟等人在Cell Discovery杂志在线发表题为“Artificial sgRNAsengineered for genome editing with new Cas12b orthologs”的文章，该文章发现即使没有CRISPR阵列也可以促进Cas12b核酸酶进行精确的多重基因组工程。

另外，iNature还发现李伟/周琪团队：2019年2月25日，在Nature Communications上发表题为“Preciselycontrolling endogenous protein dosage in hPSCs and derivatives to model FOXG1syndrome”的文章，提出了一套hPSCs系统，利用CRISPR/Cas9和 SMASh技术，通过该系统可以在神经分化的多个阶段对内源性蛋白进行精确的剂量控制（中科院动物所胡宝洋团队开发精确调控内源蛋白丰度的新系统）；2019年1月8号，在Cell Reports在线发表题为“Derivation of Mouse Haploid Trophoblast Stem Cells”的研究论文，该论文报告了小鼠孤雌生殖的单倍体TS细胞（haTSCs）的产生，并表明补充FGF4和抑制Rho相关蛋白激酶（ROCK）能够维持其单倍体和发育潜力。另外，还证明了haTSC经历遗传操作并促进滋养层细胞谱系全基因组筛选的能力（周琪/李伟团队及帅领团队同时发文，建立了新型单倍体干细胞）。

为了探索新的Cas12b直系同源物，研究人员合成了四种来自不同细菌（BhCas12b，Bs3Cas12b，LsCas12b和SbCas12b）的未报道的Cas12b家族蛋白以及四种先前报道的Cas12b直向同源物（AaCas12b，AkCas12，AmCas12b和BsCas12b）进行基因组编辑。为了进行哺乳动物基因组编辑，共转染293T细胞与单独的Cas12b酶及其同源嵌合单指导RNA（sgRNA），靶向含有适当PAM的人内源基因座。 T7核酸内切酶I（T7EI）测定的结果显示，除了先前报道的AaCas12b和AkCas12b4之外，四种新型Cas12b直系同源物（AmCas12b，BhCas12b，Bs3Cas12b和LsCas12b）也可编辑人类基因组，尽管它们的靶向效率在不同靶向位点处会有变化。通过编程Bs3Cas12b还可以实现多重基因组工程，通过简单地使用多个sgRNA同时编辑人类基因组中的四个位点。

有趣的是，研究人员发现这些Cas12b直向同源物的氨基酸序列是高度保守的。同时，pre-crRNA：tracrRNA双链体及其二级结构的DNA序列也是高度保守的。这些结果提醒Cas12b系统中Cas9和Cas12a系统中的RNA：Cas组分的可互换性也可能存在。为了研究Cas12b系统中两种成分的可互换性，在293T细胞中进行基因组编辑，其中单独的Cas12b直向同源物与源自八种系统的同源和非同源sgRNA复合。作为T7EI测定的结果表明，来自AaCas12b，AkCas12b，AmCas12b，Bs3Cas12b和LsCas12b基因座的非同源sgRNA可以替代同源sgRNA用于哺乳动物基因组编辑，尽管它们的活性在不同的Cas12b直向同源物和sgRNA之间变化。

用于人工gRNA引导基因组编辑的同源Cas12b蛋白

总之，研究人员设计了一系列用于哺乳动物细胞基因组编辑的Cas12b直系同源物，扩展了基于Cas12b的基因组工程工具箱。重要的是研究结果启发了RNA组分设计的原则，即使没有CRISPR阵列也可以促进Cas12b核酸酶进行精确和多重基因组工程，虽然尚未阐明负责Cas12b-RNA-DNA复合物切割能力的sgRNA支架中的确切碱基。