Nature |核小体滑动如何影响转录因子与DNA的选择性结合？

源：BioArt

撰文： 十一月

染色质重塑复合体驱逐、滑动、插入或者是取代而改变核小体的位置与结构形式，都是在发挥接近DNA的内在屏障的作用。这些重塑因子在譬如转录因子的结合、DNA复制与DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。尽管已有一些研究表明，染色质重塑因子在癌症细胞中会高频率发生突变，但是整体上这些染色质重塑因子是如何正常协调核小体的组织结构还研究地很不清楚。

近日，来自于瑞士Friedrich Miescher Institute与巴塞尔大学的Dirk Schübeler研究组在Nature上发表研究，题为Mammalian ISWIand SWI/SNF selectively mediate binding of distinct transcription factors，对染色质重塑因子尤其是ISWI复合物对于核小体周期性与细胞核组织结构进行了揭示，发现转录因子在基因组上的正确结合也同样依赖于特定的重塑因子的活动。

哺乳动物的染色质重塑因子复合物包括四个家族，分别是SWI/SNF、ISWI、CHD与INO80，其功能主要是协调整体的核小体组织结构。为了研究染色质重塑因子对于转录因子特异性结合的作用，作者们建立了ISWI复合物中SNF2H因子缺失型胚胎干细胞，SNF2H是ISWI复合物的ATP酶，与之相应的是另外一个复合物SWI/SNF中的ATP酶BRG1缺失型胚胎干细胞。BRG1的敲除，使得一些多能性转录因子比如OCT4、SOX2以及NANOG的DNA结合能力有显著降低，表明SWI/SNF对于转录因子结合能力的影响与体外驱逐核小体的能力是一致的【1】。但是对于ISWI家族在体内的功能还很不清楚。ISWI复合物包括两个催化亚基：SNF2H和SNF2L。SNF2H在哺乳动物体内形成五个重塑因子复合体：ACF、CHRAC、NoRC、WICH以及RSF【2】。体外实验发现，这些复合物并不会将核小体驱逐出去，而是会沿着DNA滑动核小体，因此他们可能是通过调整linker DNA的长度作为“标尺”来发挥功能。需要强调的一点是在SNF2H敲低的HeLa细胞中CTCF集合位点周围的核小体定位会明显降低。

作者在建立了SNF2H敲除小鼠胚胎干细胞的基础上，想要进一步确认SNF2H的催化活性对于该染色质重塑复合物发挥功能是否具有重要作用。他们发现SNF2H KO的小鼠胚胎干细胞相较于野生型细胞具有正常的形态，细胞周期也没有大幅度的改变同时也能够形成正常的细胞群落，但细胞的增殖能力明显降低。为了确认SNF2H催化活性的作用，他们将野生型的SNF2H蛋白或者是包含破坏ATP酶活性的点突变形式的蛋白回补到SNF2H KO的小鼠胚胎干细胞中。他们发现只有野生型的SNF2H蛋白可以正常恢复干细胞的增殖能力，而ATP酶活性被破坏的形式回补之后则不能恢复细胞增殖能力，说明SNF2HKO的干细胞的增殖能力的降低是由于ATP酶活性的缺失而不是由于该复合体的组装受到影响。

研究者通过微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease, MNase）消化产生单核小体片段并进行深度测序进一步确认了SNF2H对于核小体模式的影响。可以发现，在SNF2H KO的小鼠胚胎干细胞中核小体的相位明显降低，但是野生型而非ATP酶活性突变型SNF2H蛋白可以回补这种变化（图1）。

图1 远端DNase I超敏感位点核小体的相位在不同基因型的以及不同形式的回补实验的变化图。

DNA甲基转移酶对于甲基化的linker DNA具有偏好性，因此内源DNA的甲基化的核小体的相位也会有明显的变化。通过亚硫酸氢钠测序法（Bisulfitesequencing）发现SNF2H的缺失会明显降低核小体的相位。通过ATAC-seq（Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing）来确认核小体重复长度（Nucleosomal-repeat length, NRL）在野生型与SNF2H敲除细胞中的变化。通常ATAC-seq用于确认基因组中的开放调控区域，但也可用于产生单体、二体或者是三体的核小体。通过ATAC-seq发现，在缺失SNH2H的情况下，NRL增加了约9个碱基（图2）。

图2基于MNase酶的核小体NRL的距离变化。

研究者通过筛选SNF2H KO小鼠胚胎干细胞基因组中可接近性发生变化的区域找到了一些具有序列结合特异性的转录因子。其中找到了非常重要的转录因子CTCF与REST，这两个转录因子具有相似的DNA结合结构域并且高度特异的识别一个较大的17bp的基序。但是通过ChIP-seq作者们发现，CTCF会对SNF2H敲除后结合DNA的能力产生响应，而REST则不会（图3b）。REST只特异性地对BRG1敲除后产生响应（图3e）。因此，不同染色质重塑因子对于不同转录因子结合DNA的能力的作用具有特异性。

图3 CTCF与REST在不同的基因型的小鼠胚胎干细胞中的ChIP-seq结果。

总的来说，SNF2H的缺失会造成linker DNA的长度增加，同时也会降低核小体相位，这证明了ISWI染色质重塑复合体在哺乳动物体内具有核小体“标尺”的功能，而且这种“标尺”功能具有特异性，并非所有的染色质复合体都具有该功能。另外，一系列依赖于ISWI复合物的转录因子说明核小体滑动对于转录因子的结合非常重要。ISWI复合物对于CTCF的结合的影响说明染色质重塑复合体对于细胞核组织结构非常关键，也阐释了这类蛋白是如何在DNA为模板的事件中发挥作用的，这对于基因组的三维结构组成给予了一些可能的解释。