起跑过程中刹车的精细调控——T细胞活化阶段PD-1抑制性信号的调控机制

来源：ScienceAAAS

中科院青促会 李颖

（中科院生物物理研究所）

评述论文：Restriction of PD-1 function by cis-PD-L1/CD80 interactions is required for optimal T cell responses （Science 19 April 2019: Vol 364, Issue 6437）

肿瘤免疫治疗在近十年间得到了举世瞩目的突破性发展。其中，T细胞表面抑制性受体的发现，以及其阻断性抗体（也被称为免疫检查点抑制剂）在癌症治疗中的运用和疗效堪称为肿瘤免疫治疗的里程碑事件。抑制性受体CTLA-4和PD-1分子的发现者（美国的詹姆斯•艾利森（James Allison）与日本的本庶佑（Tasuku Honjo））也因此获得了2018年的诺贝尔生理学或医学奖。这两个分子虽然同为T细胞表面抑制性受体，但发挥功能的机制完全不同。CTLA-4主要在淋巴器官的T细胞活化（priming）阶段发挥作用，通过与T细胞激活性受体CD28竞争性结合共同的配体B7家族分子CD80（B7-1）和CD86（B7-2），抑制T细胞的过度活化。PD-1则主要在外周组织的T细胞效应（effector）阶段发挥作用，通过结合外周组织细胞上的配体PD-L1（B7-H1），抑制T细胞的过度反应。而这一机制被肿瘤细胞利用，通过上调PD-L1的表达，与肿瘤特异性T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞的杀伤功能，从而实现肿瘤的免疫逃逸(1, 2)。

CD80/CD86—CD28/CTLA-4信号通路在抗原递呈细胞激活T细胞的过程中，发挥关键的调控作用，CD28激活信号和CTLA-4抑制信号协同作用，调控了T细胞反应的适度发生(3)。PD-1的配体PD-L1和PD-L2也高表达在抗原递呈细胞（APCs）表面，和CTLA-4一样，PD-1在T细胞激活后也很快被诱导表达在T细胞表面。但是，PD-L1/PD-L2—PD-1信号通路在T细胞活化阶段的调控作用及调控机制尚不清楚。另外，这两个信号通路之间具有直接调控作用，即PD-L1可以结合CD80 (4, 5)，这两个分子相互作用的生物学意义也是很有意思的科学问题。

本期《科学》杂志上由日本德岛大学Taku Okazaki教授及其团队发表的一项研究工作，对这一调控机制进行了探讨。首先，T细胞活化阶段的PD-1分子能否与APCs上表达的配体结合？研究人员为此制备了PD-1的胞外区蛋白（PD-1-EC），检测了PD-1-EC与原代培养的三种小鼠APCs的结合，分别是LPS促成熟后的脾脏来源的树突状细胞CD8a+ DCs、CD11b+ DCs以及巯基乙酸盐（TG）诱导的腹腔巨噬细胞（TG-Mf）。结果显示，PD-1-EC能与低表达CD80的TG-Mf结合，而不能与高表达CD80的DCs结合，但可以结合CD80敲除的DCs，从而提示PD-1-EC与DCs的结合与DCs上CD80的表达水平负相关。接下来，研究人员在敲除PD-L1的小鼠B细胞系IIA1.6中，通过分别过表达PD-L1、PD-L2、CD80、CD86，证明同一个细胞上PD-L1与CD80的结合（cis-PD-L1/CD80）阻断了PD-L1与PD-1的结合，不同细胞上PD-L1与CD80的结合则不影响PD-L1与PD-1的结合（图一）。免疫共沉淀实验的结果也表明PD-L1能直接结合CD80，但不结合CD86。那么，这种结合的差异对T细胞的功能有什么直接影响？研究人员以B细胞系IIA1.6作为APC刺激活化CD4+ DO11.10 T细胞，检测细胞因子IL-2的产生。结果显示，在APC上过表达PD-L1抑制PD-1+T细胞中IL-2的产生，但这种抑制会被APC上同时过表达CD80解除；在PD-1-T细胞中则无影响。在以原代培养的APCs分别活化刺激小鼠CD8+ OT-I、CD4+ OT-II T细胞的实验中，也得到相同结果。以上结果说明，在T细胞活化阶段，APCs细胞上cis-PD-L1/CD80相互作用能够阻断PD-L1与T细胞上PD-1相互作用，从而解除PD-1信号对T细胞功能的抑制。

图1. CD80通过与PD-L1相互作用阻断PD-L1与PD-1结合

接下来的问题是，如果CD80失去阻断PD-1/PD-L1结合的能力，是否会抑制T细胞的活化？要解决这个问题，研究人员首先通过点突变的方法寻找PD-L1/CD80的结合位点。点突变有效的判定标准是：第一，不再影响PD-1/PD-L1相互作用；第二，不影响CD80与CD28/CTLA-4的结合；第三，表达量与未突变蛋白一致。随后，研究人员通过体外结合、免疫共沉淀和T细胞功能检测，证明了PD-L1-Y56A和CD80-L107E均不能形成cis-PD-L1/CD80相互作用。更进一步地，在Cd274Y56A和Cd80L107E小鼠中，与野生型小鼠相比，分离得到的DCs能很好地结合PD-1-EC。在DCs刺激活化T细胞的实验中，Cd274Y56A和Cd80L107E小鼠的DCs均明显抑制T细胞产生IL-2的能力，而这种抑制可以被PD-L1抗体解除（图二）。此外，用OVA蛋白免疫的小鼠一周后取出引流淋巴结T细胞在体外进行再刺激实验，Cd274Y56A和Cd80L107E小鼠的T细胞同样表现出细胞因子分泌的缺陷。以上结果说明，在应对外来抗原时，PD-1信号会因cis-PD-L1/CD80相互作用而被阻断，从而促进T细胞的活化。

图2.PD-L1与CD80点突变抑制T细胞功能

最后，这一调控机制在生理情况下是否存在？研究人员分别在肿瘤模型和自身免疫病模型中进行了研究。在E.G7荷瘤小鼠中，分别采用poly(I:C)作为佐剂或者BMDC作为APC负载抗原的方法，对小鼠进行OVA抗原疫苗的治疗（图三）。结果显示，在野生型小鼠中疫苗能显著抑制肿瘤的生长，但是在Cd274Y56A和Cd80L107E小鼠中疫苗无法发挥抗肿瘤作用。在进一步的分析中发现，与野生型小鼠相比，Cd274Y56A和Cd80L107E小鼠中递呈抗原的DCs能有效结合PD-1-EC，同时抗原特异性T细胞的频率和数量也明显减少，提示T细胞的活化和扩增受到抑制。而在自身免疫病EAE模型中，Cd274Y56A和Cd80L107E小鼠的发病症状明显减轻，提示自身反应性T细胞的功能受到抑制。

图3.PD-L1与CD80点突变抑制抗肿瘤免疫反应

总结起来，这项工作揭示了抗原递呈细胞上的CD80通过与同一个细胞上的PD-L1相互作用（cis-PD-L1/CD80）阻断PD-L1与T细胞上的PD-1结合，从而抑制PD-1信号通路在T细胞活化阶段的作用，促进T细胞的活化。我们知道，CD80作为共刺激分子通过与原始（naive）T 细胞上的CD28结合，促进T细胞活化。一旦T细胞活化，CTLA-4和PD-1被诱导表达，CTLA-4与CD28竞争结合CD80和CD86，抑制T细胞的活化；PD-1与PD-L1和PD-L2结合，也对T细胞活化进行“刹车”。而该研究中的cis-PD-L1/CD80并不影响CD80与CD28或CTLA-4的相互作用，提示CD80在被CTLA-4竞争结合后，仍然能通过与APC细胞上PD-L1的结合，释放“PD-1刹车”，来给T细胞活化“加油”。这项工作进一步说明，机体免疫反应的调控作用是非常复杂的，通过多层次的精细调控，从而保证健康机体免疫反应的适度发生。值得一提的是，该研究是通过细胞水平上过表达或敲除这两个分子，在保持其它条件恒定的条件下，证实了cis-PD-L1/CD80对T细胞PD-1调控作用的存在。但是，在生理及病理条件下，cis-PD-L1/CD80相互作用对T细胞活化的调控作用，以及该调控机制的生理及病理学意义，还有待更多的工作来研究。

博士，中国科学院生物物理研究所副研究员，中科院青年创新促进会会员，主要从事抗肿瘤T细胞免疫反应相关研究。

参考文献：

1. M. F. Sanmamed, L. Chen, A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization. Cell 175, 313 (Oct 4, 2018).

2. A. Ribas, J. D. Wolchok, Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science 359, 1350 (Mar 23, 2018).

3. S. Wang, L. Chen, T lymphocyte co-signaling pathways of the B7-CD28 family. Cellular & molecular immunology 1, 37 (Feb, 2004).

4. M. J. Butte, M. E. Keir, T. B. Phamduy, A. H. Sharpe, G. J. Freeman, Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses. Immunity 27, 111 (Jul, 2007).

5. J. J. Park et al., B7-H1/CD80 interaction is required for the induction and maintenance of peripheral T-cell tolerance. Blood 116, 1291 (Aug 26, 2010).