进展：单分子研究揭示DNA同源重组中链交换扩展的分子机理

来源：中科院物理所

基因的同源重组是由重组酶介导的、发生在相同或相近的两条DNA链之间的链交换，对于维持遗传稳定性和生物多样性具有重要意义。同源重组现象的发现已有几十年历史，同源识别和链交换是同源重组过程中最重要的步骤，但由于其反应中间产物停留时间短并且状态复杂，常规方法难以捕捉，因而其分子机理仍十分模糊。

最近，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心软物质实验室SM4组的徐春华副研究员、陆颖副研究员以及黄星榞博士等，运用单分子磁镊和荧光成像技术，通过巧妙的实验设计，捕捉到同源重组链交换的中间态，在体外再现了链交换的步进过程，并推测出过渡态结构的存在，建立了RecA介导的同源重组的行波模型，阐述了同源重组中序列识别和链交换的分子过程。

作为重组酶的代表，RecA几乎能够独立完成同源重组中的链交换过程。RecA介导的同源重组可简略描述为：发生双链断裂的DNA末端在相关蛋白的作用下，形成31单链突出，这段单链可以被RecA缠绕形成螺旋丝状结构（核蛋白丝nucleoprotein filament）;核蛋白丝入侵到双链DNA中，搜寻与之同源的序列并发生链交换。核蛋白丝中的入侵链(I链)替换同源双链DNA中的被替换链(O链)，与互补链(C链)形成新的双链，如图1A左图所示。在本研究中，研究人员使用发卡结构DNA（hairpin DNA）与RecA形成的核蛋白丝来模拟同源重组的扩展过程，如图1A右图所示（虚线框内部分与左图虚线框相对应），核蛋白丝在发卡DNA开口处发生链交换，每一步打开一定数量的碱基对，体现为磁球高度的步进式变化，以此在体外再现链交换的步进过程。

在研究中，他们意识到链交换反应的中止或许能够体现出中间态的信息，从而得到更多链交换反应的细节。因此，研究人员设计了一系列包含不同错配碱基的DNA，从单分子尺度上观察链交换反应的动力学现象。他们意外地发现链交换的终点竟然不在界面（错配序列与同源序列的交界处定义为界面），而是被完全错配序列阻挡于界面之前9 bp的位置（图1B和C）。

图1.用单分子磁镊观察链交换反应。（A）使用120 bp的发卡DNA来模拟供体双链DNA。（B）链交换反应的典型曲线，部分序列为错配碱基。（C）链交换反应长度的分布。蓝色点划线表示界面的位置，红色虚线表示界面前9 bp的位置。

逻辑上讲，同源序列比对过程应发生在链交换反应之前，且必然越过界面，否则核蛋白丝无从得知界面后的DNA序列是否同源。因此在界面前9 bp到界面之间的9个同源碱基也应被比对过。那么，为什么这9个碱基没有发生链交换反应？这个结果暗示了链交换反应中，在序列比对态与已换链态之间存在着一个9 bp的过渡结构。由于这个结果过于意外，研究人员用酶切保护实验和荧光共振能量转移（FRET）实验（图2）两种方法进行了进一步证实。此外，FRET实验提供了双链DNA结构的重要的信息，未参与反应的双链DNA会以接近垂直的角度从核蛋白丝中弯折出来。

图2.使用FRET实验研究链交换反应。（A）实验示意图。当反应结束时双链DNA从核蛋白丝中弯折出来。蓝色点划线表示界面的位置，红色虚线代表界面前9 bp的位置。（B）左侧为典型的FRET实验曲线，后18个碱基为完全错配序列。右侧展示的为是终态FRET值的统计分布。（C）与（B）相同，后18个碱基为50％错配序列。

通过磁镊和FRET实验，研究人员还测量了链交换和同源序列比对的步长，他们发现虽然3 bp仍然是链交换的基本单位，但同源序列比对与链交换的步长都更倾向于以3 bp的整数倍发生，最概然的步长均为9 bp。同时，前面提到的过渡结构也为9 bp。结合实验和理论，研究人员建立了一个链交换模型，在这个模型中链交换过程像行波一样推进：在最前端，双链DNA会以9 bp为步长与核蛋白丝中的单链进行同源序列比对，后面紧跟着一个9 bp的过渡态，最后则是已经发生链交换的双链DNA，反应模型如图3所示。

图3.同源重组过程的步骤分解。（A-D）同源序列间的链交换过程，C链分为3个部分，已换链态（红色），过渡态（蓝色）以及序列比对态（绿色）。（E-H）同源重组过程被非同源序列阻挡的情况。同源比对态跨过界面位置。I链的同源序列表示为黄色，非同源部分为黑色。核蛋白丝上的RecA蛋白为了展示方便而隐去。

该工作以“Mismatch sensing by nucleofilament deciphers mechanism of RecA-mediated homologous recombination”为题，发表于Proc. Natl. Acad. Sci. USA（DOI：10.1073/pnas.1920265117）。此工作得到了国家自然科学基金、中国科学院前沿科学重点研究计划、中国科学院青年创新促进会以及王宽诚教育基金的支持。