来源：iNature
基因组编辑具有纠正病原突变的巨大潜力。研究人员开发了一种称为GOTI的方法，以通过使用CRISPR–Cas9或碱基编辑器编辑两细胞小鼠胚胎的一个卵裂球来检测脱靶突变。GOTI直接比较编辑过的和未编辑过的细胞而不会受到遗传背景的干扰，因此可以高灵敏度地检测潜在的脱靶变异。值得注意的是，GOTI方法旨在通过结合实验和计算方法来检测任何基因组编辑工具的潜在脱靶变异体，这对于准确评估基因组编辑工具的安全性至关重要。
2020年8月14日，中国科学院神经研究所杨辉，中国科学院上海营养与健康研究所李亦学及斯坦福大学Lars M. Steinmetz共同通讯在Nature Protocol 在线发表题为“GOTI, a method to identify genome-wide off-target effects of genome editing in mouse embryos”的研究论文，该研究为GOTI提供了详细的技术方案，包括小鼠交配，两细胞胚胎注射，胚胎第14.5天胚胎消化，荧光激活细胞分选，全基因组测序和数据分析。
为了增强GOTI的效用，该研究还包括一个称为GOTI-seq（https://github.com/sydaileen/GOTI-seq）的计算流程，用于测序数据分析，可以生成最终的全基因组脱靶变异体直接从原始测序数据中提取。从小鼠交配到测序，该试验方法通常需要20天，而测序数据分析则需要7天。
大多数CRISPR–Cas9编辑的靶点通常在目标位点包含小插入缺失，这是由于响应双链断裂（DSB）的非同源末端连接所致。另一方面，碱基编辑器在目标基因座处使用脱氨酶诱导碱基对取代，而不产生DSBs。DNA碱基编辑器有两类：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）将C•G碱基对转换为A•G碱基对，而腺嘌呤碱基编辑器（ABE）将A•G碱基对转换为G•C碱基对。然而，脱靶突变的问题可能会导致遗传不稳定和功能障碍。
具体而言，脱靶效应的潜力仍然是将基因组编辑应用于人类基因治疗的主要障碍。已开发出多种技术来检测细胞中全基因组编辑脱靶活性，包括选择性富集和通过测序（SITE-seq），高通量全基因组易位测序（HTGTS）等方法。但是，这些方法只能从通过基因组编辑生成的DSB中检测脱靶，因此不适用于体内检测单核苷酸变体（SNV）。鉴于碱基编辑器的应用迅速增加，人们迫切需要开发一种技术来以无偏见的方式全面评估脱靶效应。
最近，研究人员开发了一种称为GOTI的全基因组脱靶效应检测方法，用于从头鉴定小鼠胚胎中脱靶突变。这项技术检查源自单个基因编辑的卵裂球的细胞群中的脱靶效应，而先前的研究使用了大量细胞，其中基因编辑结果是可变的，由于群体平均，导致随机脱靶效应的信号丧失。此外，由于编辑和未编辑的细胞来自一个祖先细胞，因此GOTI可以使遗传背景和体细胞突变的任何混杂影响最小化。因此，GOTI可以被普遍用于不引入DSB的基因组编辑工具。
在本文中，研究人员系统地描述了GOTI和GOTI-seq的实验方案。该研究还强调需要特别注意的特定步骤和小技巧，以确保生成的数据质量。GOTI方法可广泛应用于评估动物模型中基因组编辑工具的特异性。
参考消息：https://www.nature.com/articles/s41596-020-0361-1
来源：Plant_ihuman iNature
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MTE3MjUyOA==&mid=2247513881&idx=4&sn=61a6392ef255cebe1a23c5b71d5d8a75&chksm=fce6c4c6cb914dd0d00debb603f02f20d078559ed4e614d8fcbc0b05db42375fbeb99b9561b5#rd
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