华人团队开发新型基因编辑系统，高效实现基因大片段敲除，为攻克病毒性疾病带来新希望

来源：iNature

原标题：Mol Cell | 华人团队开发新型基因编辑系统，高效实现基因大片段敲除，为攻克病毒性疾病带来新希望

CRISPR/Cas系统是细菌和古菌中独有，而且广泛存在的一种免疫防御系统，通过对核酸的切割作用来抵御病毒和外源核酸的入侵。该系统于2012年被解析，并于2013年由张锋等人首次用于哺乳动物系统的基因组编辑。此后CRISPR/Cas基因编辑系统的到了迅速发展和应用。

截止到目前，成功应用于真核系统基因编辑的Cas9、Cas12以及Cas13均属于Ⅱ型CRISPR/Cas，Ⅱ型只需要单一蛋白酶执行核酸的切割，相对简单易用。然而，Ⅰ型CRISPR/Cas在细菌和古菌中的分布更为广泛，占比超过90%，但目前还没有Ⅰ型CRISPR/Cas系统成功进行真核细胞的基因编辑。

2019年4月8日，Cell 子刊 Molecular Cell 杂志在线发表了题为：Introducing a spectrum of long-range genomic deletions in human embryonic stem cells using Type Ⅰ CRISPR-Cas 的研究论文。

该研究表发现CRISPR/Cas3可以在人胚胎干细胞中实现大片段的基因敲除（几百bp-100kbp），编辑效率高达13％-60％。这是Ⅰ型CRISPR/Cas系统首次在真和系统实现基因编辑，这一发现表明Ⅰ型CRISPR/Cas系统在真核系统中有巨大的基因编辑潜力和应用价值。

CRISPR/Cas3可以有效的从人类基因组目标位点进行大片段敲除，效率远超传统的CRISPR/Cas9系统。Cas3的这一能力对于清除单纯疱疹病毒、EB病毒、乙肝病毒这些异位整合的顽固病毒，带来了巨大希望。

通讯作者：张燕（密歇根大学）、柯爱龙（康奈尔大学）

对于目前研究的最成熟、应用最广泛的CRISPR/Cas9系统来说，Cas9系统使用sgRNA来识别目标DNA序列，识别匹配后，sgRNA将Cas9蛋白精确引导到目的DNA序列，然后Cas9蛋白就会在正确的位置切割目标DNA。CRISPR/Cas3使用相同的机制来定位目标DNA序列，然而，Cas3不是仅仅将DNA双链一切为二，而实会连续消除DNA片段，最多可长达100K碱基对。

该研究在人类胚胎干细胞和HAP1细胞中，使用该系统成功敲除了长达100Kbp的DNA超长片段。

超过98％的人类基因组是非编码序列，这些非编码含有对基因调控和疾病很重要的顺式作用元件。然而，这些大片段的非编码序列，目前还没有得到很好的表征。之前通常使用一对sgRNA引导的CRISPR/Cas9来实现对大片段基因组的敲除。这种方法费时费力，而且效率比较低。

这项研究表明，CRISPR/Cas3可用于有效筛选非编码遗传元件并实现大片段的基因敲除。一旦成功被敲除，就能够通过检查生物体或细胞中缺少哪些功能，从而确定该DNA片段的作用。

这种Ⅰ型CRISPR/Cas能够从单个靶向位点产生多样的大片段DNA缺失，使得针对大片段DNA功能的CRISPR筛选更简单且更具成本效益，因为所需的sgRNA更少，而且每个sgRNA都会导致一个片段缺失突变体库。

单纯疱疹病毒、EB病毒、乙肝病毒，它们在全世界范围内感染了数以亿计的人，除了疫苗预防，并没有很好根治方法。CRISPR/Cas3具有的长片段DNA敲除能力，能够很好的定位和清除这些病毒基因组，从理论上来说，CRISPR/Cas3为根治这些病毒性疾病提供了有前景的治疗手段。

CRISPR/Cas3具有比CRISPR/Cas9对基因组更大的影响范围，但研究人员正在努力控制Cas3对DNA敲除的长度。目前还无法准确定义其敲除边界，这对于治疗来说是一个必须要解决的缺点。

总的来说，该研究首次将Ⅰ型CRISPR/Cas系统成功引入真核基因编辑，极大地扩展基因组工程工具包。Cas3的大片段敲除能力，为表征非编码序列带来有力工具，为清除病毒基因组，攻克病毒感染性疾病带来有前景的方法。