利用CRISPR/LbCpf1基因编辑系统创制出非转基因无棉酚棉花材料

来源：植物科学最前沿

棉花是我国重要的经济作物之一，是天然纤维，植物蛋白的重要来源。目前种植最多的异源四倍体棉花因其庞大而复杂的基因组，大多数基因在At和Dt亚基因组多个同源拷贝，给棉花基因组功能研究带来巨大挑战。本课题组前期研究表明Cpf1（Cas12a）蛋白在棉花中具有较好的基因编辑能力，这套系统与Cas9 系统相比具有具有很多特点或优势：该系统能够识别富含胸腺嘧啶（T）的PAM 位点，扩大了基因组编辑的靶点范围；Cpf1剪切DNA后形成黏性末端，让DNA插入更可控； 倾向于产生大片段缺失、特异性强、编辑效率高，因此可以用做未来棉花基因组编辑的重要工具之一，能够和传统的CRISPR/Cas 9系统形成良好的互补。同时有研究表明Cpf1蛋白属于温度敏感性蛋白，发现CRISPR/LbCpf1介导的基因组编辑容易受到温度的影响，并且特定的温度处理能实现更高的编辑效率。

2020 年 8 月 27 日，植物学领域主流期刊Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了华中农业大学棉花遗传改良团队题为 "The application of temperature sensitivity CRISPR/LbCpf1 (LbCas12a) mediated genome editing in allotetraploid cotton (G. hirsutum) and creation of nontransgenic, gossypol‐free cotton" 的研究论文，该论文验证CRISPR/LbCpf1介导的基因组编辑系统在棉花基因编辑中的“嗜热性”，进而可以利用棉花对高温有较好耐受性的特点，创制了纯合、无棉酚的非转基因（Transgene free）棉花材料，为棉花分子育种提供了新的种质资源。

为了进一步研究CRISPR/LbCpf1在棉花中的温度敏感性，是否特定的温度处理有助于实现更好的编辑效率。该研究构建了棉花腺体基因GhPGF基因 LbCpf1的编辑载体。并与前期的叶绿素合成相关基因GhCLA的LbCpf1的编辑载体获得的棉花植株同时验证Cpf1蛋白的温度敏感性。研究结果发现: 在棉花中CRISPR / LbCpf1系统的最佳诱导温度为34℃。在此温度下，与24℃和29℃相同，所有T0植物的目标位点仅检测到DNA缺失，编辑效率明显高于24℃和29℃；敲除GhPGF靶基因中的两个crRNA都被突变。然而，在24℃和29℃处理后，只有第一个crRNA发生突变，第二个crRNA几乎没有突变。经过34℃处理后，靶标序列的两个crRNA都有突变。更重要的是，白化和无腺体的的表型更为明显；通过qRT-PCR 检测棉花中LbCpf1的表达水平表明在34℃时LbCpf1蛋白的活性最高；脱靶分析表明：LbCpf1系统在34℃下对棉花基因组没有发现脱靶作用。在此基础上，通过筛选获得了不含棉酚非转基因、无腺体棉花植株，为棉花育种提供了宝贵的种质资源。

总之，研究表明在34℃条件下是CRISPR/LbCpf1在棉花中表达活性的最适温度，因此，在种子萌发或植物组织培养过程中，通过简单的热处理就可以提高棉花的编辑效率。同时，纯合、非转基因和无棉酚的棉花材料的创制为分子育种提供了宝贵的新种质。

图1:不同温度下田间LbCpf1-GhCLA植株受温度的影响

图2:不同温度处理后LbCpf1-GhCLA和LbCpf1-GhPGF植株受温度的影响

图3：CRISPR/LbCpf1介导的纯合、非转基因和无棉酚的棉花材料的创制

图4:不同温度处理后LbCpf1蛋白的表达量差异及无酚纯合植株的检测

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室张献龙教授、金双侠教授为该论文的共同通讯作者，博士生李波和已毕业博士梁思佳为共同第一作者。该研究受到国家科技部转基因专项（2019ZX08010-003和2016ZX08005-001-006）、国家重点研发项目(2016YFD0100203-9)的支持。