利用高通量单细胞分辨率3D图像技术研究乳腺肿瘤内克隆可塑性

来源：BioArt

撰文 | 觉主在路上

肿瘤细胞在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出基因和（或）形态改变的特性被称作肿瘤异质性（heterogeneity），这种特性产生的主要机制包括克隆进化模型（随机获得并积累基因突变从而产生适应性更强的细胞克隆）、肿瘤干细胞模型（具有干细胞特质的肿瘤细胞克隆进行自我更新和多分化）和肿瘤微环境模型（对肿瘤特定区域产生不同的选择压力），这些机制也可同时发生在同一肿瘤当中【1】。肿瘤异质性表现在肿瘤内部产生生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性等各方面存在差异的子细胞克隆，这些子细胞克隆可存在于肿瘤内不同区域，并会处于不断的动态变化过程当中。在这个动态变化过程当中，肿瘤子细胞克隆呈现复杂的表型变化，并伴随多种生物学功能的差异的特性被称为肿瘤细胞可塑性。上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和肿瘤干细胞(cancer stem-like cell, CSC) 表型变化是肿瘤细胞可塑性的两个重要表现【2】。

肿瘤治疗策略的制定因为肿瘤的异质性变得更加复杂，肿瘤治疗不能仅只针对某个基因或信号通路，还要随时针对治疗过程中产生的新细胞克隆【3】。因此，获取每个肿瘤子细胞克隆和全肿瘤空间异质性的全部信息变得尤为重要。而高分辨率3D成像技术联合免疫荧光标记技术能够展现整个肿瘤内子细胞克隆多样性及分布。为了获得最佳图像，肿瘤样品制备过程，尤其对透明技术具有较高要求。而目前使用的透明技术或是需要较长时间和多重步骤 【4】，或是透明过后组织有明显的皱缩或结构变形【5】。

近日，来自澳大利亚The Walter and Eliza Hall 研究所的Jane E. Visvader教授团队开发了一种快速、高通量单细胞分辨率3D成像技术（Large-scale Single-cell Resolution 3D imaging， LSR-3D）操作方法，联合多颜色谱系示踪技术和RNA测序技术，对乳腺肿瘤内细胞可塑性进行了研究。该成果以Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging为标题发表在了Cancer Cell上。

研究人员首先对乳腺组织透明方法进行了研究探索。在对组织进行固定和荧光标记之后，使用包含以果糖、尿素和甘油为透明试剂（FUnGI）的方法（LSR-3D）进行成像，该方法优点是无毒性，简单快速，室温下透明时间仅需2小时，乳腺组织结构保存完整，细胞特异性组织标记清晰可见，透明过后的组织也可在-20C下完整保存至少18个月。

接下来，研究人员将LSR-3D与多颜色荧光报告系统Rosa26R-confetti【6】相结合，研究乳腺癌变过程中子细胞克隆的动态变化。研究人员对基因工程小鼠使用外源化学致癌诱导剂（某基因-rtTA/TetO-cre/R26R-confetti）和体内Trp53和Pten基因突变（某基因-rtTA/TetO-cre/Ptenf/f/Trp53f/f/R26R-confetti）两种方法诱导其肿瘤发生，并对Krt5标记的基底层细胞和Elf5标记的管腔祖细胞分别进行谱系追踪发现，在癌变过程中，基底细胞会产生大量管腔细胞克隆，这些克隆随着癌变进程进行大量扩增，证明管腔祖细胞可以直接参与早期癌变的发生。

为了了解乳腺肿瘤内不同克隆之间分子水平的变化，研究人员进一步对小鼠（某基因-rtTA/TetO-cre/Ptenf/f/Trp53f/f/R26R-confetti）内肿瘤不同颜色单细胞克隆使用FACS筛选富集，同时进行CD29（管腔层细胞标志）和CD24（基底层细胞标志）染色，进一步RNA测序分析。测序结果显示，不同肿瘤内不同细胞克隆（荧光颜色）可具有不同比例的基底和管腔细胞；在所有检测的肿瘤当中发现，大部分肿瘤子细胞克隆中都有一群高表达间质细胞特性基因（EMT转化）的细胞，并占有较大比例，从而证明了肿瘤细胞在分化过程中具有不稳定性/可塑性。

这项研究的重要意义在于，开发了基于透明介质FUnGI的高通量3D实体瘤成像技术（LSR-3D），使得高分辨率全组织成像技术变得更加简单、快速，组织保存更加完整，图像更加清晰；通过结合谱系示踪和RNA测序技术，发现了乳腺肿瘤子细胞克隆主要起源于管腔祖细胞，且这些肿瘤子细胞克隆频繁发生EMT，从而推进乳腺肿瘤细胞癌变的发生发展。本研究同时从图像和分子水平展示了乳腺癌癌变过程中肿瘤细胞的发生和发展过程。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.02.010

制版人：半夏

参考文献

1. Lawson, Devon A., et al. "Tumour heterogeneity and metastasis at single-cell resolution." Nature cell biology 20.12 (2018): 1349.

2. da Silva-Diz, Victoria, et al. "Cancer cell plasticity: Impact on tumor progression and therapy response." Seminars in cancer biology. Academic Press, 2018.

3. Dagogo-Jack, Ibiayi, and Alice T. Shaw. "Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies." Nature reviews Clinical oncology 15.2 (2018): 81.

4. Richardson, Douglas S., and Jeff W. Lichtman. "Clarifying tissue clearing." Cell 162.2 (2015): 246-257.

5. Lloyd-Lewis, Bethan, et al. "Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods." Breast Cancer Research 18.1 (2016): 127.

6. Snippert, Hugo J., et al. "Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells." Cell 143.1 (2010): 134-144.