【分析】Angew. Chem.：LipoFRET——绘制膜蛋白跨膜轨迹

膜蛋白在生物体的代谢中起着重要的作用。研究膜蛋白特定区域在生物膜上的位置，尤其是垂直于膜方向的位置及其动态变化，对于理解膜蛋白的工作机制具有关键的意义。一些传统的技术，如核磁共振（NMR），能够给出时间和系综平均的数据。而实时追踪单个膜蛋白在膜内深度（或离膜的距离），仍然是一个挑战。

近期，中国科学院物理研究所的李明研究员、陆颖副研究员与中国科学院上海有机化学研究所的刘聪研究员等合作，利用单个供体对多个受体的荧光共振能量转移（FRET），发展了一套基于脂质体的单分子荧光方法（LipoFRET），实现了在脂质体上以单分子水平对膜蛋白荧光标记位点垂直位置的实时动态的观测，分辨率可达0.7-1 nm，并应用此方法对α-突触核蛋白（α-syn）进行了研究，获得了该蛋白在膜上运动的新的信息。该团队此前曾发展表面诱导荧光衰减（SIFA）方法，在固态衬底表面的平面膜上记录此类信息（Nat. Commun., 2017, 7, 12906）。脂质体作为一种被广泛应用于膜蛋白的研究的模型体系，拥有可调节曲率、膜流动性不受限等特性。发展在脂质体上研究膜蛋白动态过程的方法，具有天然的优势。LipoFRET对膜内和膜外区域的膜蛋白标记位点同样有效，这是该方法所独有的优势。该方法分辨率高，操作简便，对仪器的要求低，并有扩展至活细胞体系的可能，在研究膜蛋白的动力学过程并揭示膜蛋白的工作机理方面具有巨大的潜力。

研究团队以单层脂质体中包裹的台盼蓝染料（TB）作为荧光受体，以膜蛋白上标记的荧光基团作为荧光供体。FRET效率随着标记位点与磷脂膜内表面距离的减小而逐渐升高，荧光的亮度也随之降低（图1）。结合理论计算，建立了膜蛋白特定位点的垂直位置与相对荧光亮度的对应关系，从而达到追踪该位点垂直位置变化的目的。研究人员首先利用标记了荧光的单链与双链DNA验证了原理的可行性。

图1. LipoFRET方法的原理及验证

利用此方法，对单个α-syn蛋白三个代表性位点在膜上的位置与动态进行了研究（图2）。结果显示，α-syn的中间区域（T72）位于脂质体磷脂膜的外表面。而C端的无结构尾部（S129）位于溶液中。α-syn的N端（K10）插入膜中，并呈现多态的特性。随着时间的推移，其深度在各个状态之间做缓慢的切换，这是一个未被发现过的新现象。

图2. α-syn三个位点的位置及动态过程

另外，研究人员对α-syn的C端与钙离子的相互作用进行了研究（图3）。研究结果显示，钙离子的加入使部分标记在129位点的荧光基团出现了一个比原始位置更靠近膜表面的新状态，两态之间的高度差约为1.2-1.6 nm。该状态所占比例随着钙离子浓度的升高而相应增加。而相应浓度的镁离子则不会诱导α-syn的C端发生该变化。结合α-syn的C端含有较多负电荷的事实，表明α-syn的C端与钙离子可能存在特异性的相互作用。

图3. 钙离子对α-syn C端的调控

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上。刘聪研究员、李明研究员和陆颖副研究员为共同通讯作者，博士生马东飞为第一作者。

该论文作者为：Dong-Fei Ma, Chun-Hua Xu, Wen-Qing Hou, Chun-Yu Zhao, Jian-Bing Ma, Xing-Yuan Huang, Qi Jia, Lu Ma, Jiajie Diao, Cong Liu, Ming Li, Ying Lu

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Detecting single-molecule dynamics on lipid membranes with quenchers-in-a-liposome FRET

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201813888

（本稿件来自Wiley）