西湖大学党波波博士等开发出蛋白质定点化学剪切方法以代替传统生物酶切

蛋白质生物表达过程中，不同标签肽（如His-Tag、FLAG-Tag）、蛋白（如GST、MBP）往往需要被融合到目标蛋白的C端或N端以提高目标蛋白表达产率、可溶性，实现蛋白纯化。然而被融合的标签肽、蛋白最终往往需要从目标蛋白上切掉【1】。目前唯一的生物兼容性蛋白剪切方法是生物酶切，包括常用的TEV酶、thrombin酶等。然而，生物酶切经常面临许多问题：如生物酶的加入增加了后续再除去的纯化步骤；高价蛋白酶增加了大量制备目标蛋白的成本；另外很多情况下，特别对于膜蛋白，生物酶切效率往往很低【2】。

蛋白质化学剪切方法因为操作方便，成本低等优势有望解决生物酶切涉及的各种问题。然而传统蛋白质化学剪切方法因为选择性差，反应条件苛刻，并没有被广泛应用【3-7】。

2019年3月25日，西湖大学生命科学学院党波波研究员在Nature Methods上发表了题为SNAC-tag for Sequence-specific Chemical Protein Cleavage的研究论文，报道了一种可以用二价镍离子在生物兼容条件下实现蛋白质定点化学剪切的方法。

该研究将底物噬菌体展示技术引入到蛋白质化学剪切方法开发当中，采用不同金属离子对底物噬菌体文库进行高通量筛选，最终鉴定出可以被二价镍离子高效切断的多肽序列特点。研究者进而高通量合成了上百个多肽序列鉴定每个位点氨基酸性质对于剪切效率的影响，最终确定-GSHHW-剪切效果最佳，在含-GSHHW-序列的多肽剪切测试中，在0.1 M CHES, pH 8.2, 1 mM NiCl2, 22 °C, 16 h反应条件下剪切效率>95%。研究者将-GSHHW-序列命名为SNAC-tag（Sequence-specific Nickel Assisted Cleavage tag）。

图一、底物噬菌体展示筛选蛋白质化学剪切步骤。

研究者进一步在融合蛋白的体系中对SNAC-tag的剪切效率进行了验证。在几种不同的蛋白体系中（包括水溶性球状蛋白HB2225、膜蛋白3hbtmV2等），TEV酶或者thrombin酶不能对蛋白实现有效剪切的情况下，研究者引入SNAC-tag代替TEV酶底物或者thrombin酶底物从而用二价镍离子实现了这些蛋白的定点剪切。进一步测试中，研究者发现SNAC-tag和多种蛋白缓冲液、添加剂、变性剂及表面活性剂都有很好的兼容性。

图二、（a、b、c）为SNAC-tag融合到球状可溶性蛋白HB2225后相比于TEV酶的剪切效果及不同缓冲液下的剪切效果图；（d-g）为SNAC-tag融合到膜蛋白3hbtmV2后相比于TEV酶的剪切效果及不同缓冲液、变性剂下的剪切效果图。

该研究另辟蹊径，开发了可被二价特异性剪切的SNAC-tag用于融合蛋白的高效表达和剪切，并提出了参考剪切条件：蛋白浓度约1 mg/mL，1 mM NiCl2, 0.1 M CHES，0.1 M丙酮肟，pH 8.6，0.1-0.5 M NaCl，室温反应，具体条件请参考原文。该化学剪切法巧妙地避开了生物酶切的多个弊端，其优越的剪切效率，较强的生物兼容性及广泛的适用性有望取代生物酶切法造福于生物蛋白质工程的研究。

据悉，西湖大学研究员党波波博士为该文章第一作者兼通讯作者，UCSF 的WilliamF. DeGrado教授兼为通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-019-0357-3

制版人：珂

参考文献

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2. Waugh, D. S. (2011). An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr. Purif. 80(2), 283-293.

3. Gross, E. & Witkop, B. (1961). Selective cleavage of the methionyl peptide bonds in ribonuclease with cyanogen bromide1. J. Am. Chem. Soc. 83(6), 1510-1511.

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5. Dutca, L. M., Ko, K. S., Pohl, N. L. & Kostić, N. M. (2005). Platinum(II) Complex as an Artificial Peptidase:  Selective Cleavage of Peptides and a Protein by cis-[Pt(en)(H2O)2]2+ Ion under Ultraviolet and Microwave Irradiation. Inorg. Chem. 44(14), 5141–5146.

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