Nature | piRNA信号通路新调控因子

来源：BioArt

在哺乳动物发育过程中，从体细胞获得生殖细胞存在一个基本的挑战是消除和重置基因组甲基化【1】。在雄性生殖细胞中，RNA引导的DNA甲基化沉默年轻的、活跃的转座元件【2】。PIWI蛋白MIWI2以及其相关的piRNAs（PIWI-interacting RNAs）指导DNA的甲基化【3,4】。piRNAs会将MIWI2带到邻近的转座元件转录本上，但是MIWI2指导从头甲基化（de novo genome methylation）的具体机制还不得而知。

近日，英国爱丁堡大学Dónal O’Carroll研究组发文题为SPOCD1 is an essential executor of piRNA-directed de novo DNA methylation，找到了MIWI2相互作用的新型因子SPOCD1并揭开了促进年轻的转座元件甲基化沉默的具体机制。

生殖细胞产生精子和卵子是生殖和遗传的重要基础。维持生殖细胞完整性的其中一个巨大挑战是转座元件通过转座可能会造成基因突变。在哺乳动物中，DNA甲基化是转座元件沉默的重要决定因素。哺乳动物生殖细胞在发育早期阶段从体细胞中发育而来，需要生殖细胞重编程以及重新进行基因组甲基化来重置基因组DNA甲基化的模式【1】。DNMT3L是基因组甲基化中非常关键的调节因子，通过与DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C相互作用并激活DNA从头甲基转移酶的功能。小鼠胚胎发育阶段雄性生殖细胞中存在两波从头甲基化过程【5】。第一波从头甲基化过程会无差别的指导大量基因组甲基化，但是一些活跃的LINE1以及IAP元件拷贝会从第一波甲基化过程中逃脱出来，威胁生殖细胞中的基因组的完整性【5】。而此时，PIWI蛋白以及piRNAs就会大显身手通过转录后修饰以及转录后沉默机制消除这种威胁【6】。

为了揭开piRNA指导的DNA从头甲基化过程，作者们使用内源HA标记的MIWI2品系Miwi2-HA，使用抗HA的免疫共沉淀偶联定量质谱的方式对其蛋白质组学进行研究。该实验共鉴定出28个MIWI2相关蛋白（图1）。其中12个是与piRNA合成相关并且有5个是新颖的MIWI2相互作用因子；另外鉴定得到了16个相互作用因子，其中有14个是以前未知的（图1）。为了确认这些因子对于MIWI2功能的作用，首先需要该因子符合两项条件。第一，该基因表达的时间框需要严格限定在从头甲基化的时间内，与Miwi2以及Dnmt3l的表达时间相似。第二，既然是对MIWI2在细胞核中的功能具有作用，该因子需要具有入核序列（Nuclear localization signal，NLS）。通过这些标准，作者们发现了一个具有TFIIS-M以及SPOC结构域的位置功能因子Spocd1（图1）。SPOC结构域先前被发现可能会用于招募转录共抑制因子。因此，作者们认为SPOCD1作为MIWI2的相互作用因子，可能是帮助细胞核MIWI2发挥功能的重要协助因子。

图1 通过免疫共沉淀联合定量质谱检测到MIWI2相互作用因子

piRNA信号通路或者是DNA从头甲基化过程出现问题会导致雄性不育，将小鼠中精子发生过程滞留在减数分裂期并解除对于LINE1以及IAP元件的调控。为了对SPOCD1在piRNA信号通路过程中的作用进行研究，作者们建立了Spocd1-/-突变体小鼠。Spocd1缺陷会造成雄性不育，附睾中的精子完全消失（图2）。而且Spocd1-/-突变体小鼠睾丸萎缩、输精管形态异常，细胞呈现出滞留在减数分裂期早期粗线期阶段的现象（图2）。而且通过γH2AX染色以及细胞凋亡相关因子的检测，作者们发现Spocd1-/-突变体小鼠中大量细胞出现异常的DNA双键断裂以及细胞凋亡。通过RNA-seq测序技术，作者们发现在Spocd1-/-突变体小鼠中对于转座元件的调节异常类似于Miwi2突变体小鼠。这些结果说明，SPOCD1对于精子发生发成非常关键而且是转座元件抑制的重要调节因子。

图2 Spocd1-/-突变体小鼠精子发生过程异常等表型

进一步地，为了揭开SPOCD1在基因组从头甲基化过程中的作用，作者们进行了全基因组DNA甲基化高通量测序（Methyl-seq），发现在Spocd1-/-突变体小鼠精原细胞中转座元件的启动子区域甲基化出现特异性缺失，说明SPOCD1对于转座元件的从头甲基化过程是必须的而且受到piRNA信号通路的调节。但是作者们发现SPOCD1并不是作为转录或者piRNA生物发生因子发挥作用的。为此，作者们建立了一个基因敲入小鼠可以内源表达SPOCD1-HA。通过免疫染色作者们发现，SPOCD1表达严格存在于胎儿性腺细胞的细胞核中，而且严格的存在于从头甲基化过程时间框内。通过定量质谱实验，作者们发现SPOCD1与DNA从头甲基化转移酶以及一些染色质重塑因子存在相互作用。

总的来说，Dónal O’Carroll研究组的工作鉴定得到了新型的MIWI2相互作用因子SPOCD1并且发现该因子对于piRNA指导的转座元件甲基化过程是非常关键。作者们发现：1）在小鼠中敲除Spocd1会造成雄性不育但是却并不影响piRNA的生物发生或者是MIWI2在细胞核中的定位；2）Spocd1特异性表达在DNA从头甲基化时间框中并且也表达在细胞核之中；3）通过质谱实验发现SPOCD1会与内源的DNA从头甲基化酶以及一些染色质重塑因子发生相互作用。因此，作者们提出一个工作模型认为通过SPOCD1将MIWI2与新生的转座元件转录本结合，抑制染色质重塑活动和激发从头甲基化蛋白的功能。