【病例】无创产前诊断EDA基因突变致外胚层发育不良一例

来源：中华医学会围产医学分会

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本文引用格式：代鹏，赵干业，王晓锋，等.无创产前诊断EDA基因突变致外胚层发育不良一例[J].

中华围产医学杂志, 2020, 23(7):456-459. 

DOI：10.3760/cma.j.cn113903-20191031-00618

孕妇，33岁，孕2产1。孕妇因“停经11周”于2019年7 月 10 日来郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心就诊。此次孕期无放射性、有毒有害物质等接触史。孕 8 周行B 超、血常规和激素检查结果均正常。孕妇既往体健，平素月经规律，丈夫亦体健，无不良嗜好，否认近亲结婚。

2015 年孕妇阴道分娩一男婴，现4岁4个月。男婴出生1个月后因皮肤薄，面部易患丘疹，低鼻梁，小鼻，前额突出，嘴唇厚，眼眶周围皱纹形成伴有色素沉着，毛发干、色浅、稀疏等，于2015年4月在外院行外胚层发育不良征相关基因检测。先证者基因测序结果为EDA基因 c.340C>T(p.Gln114*) 半合子突变，为少汗型外胚层发育不良患者。孕妇亦行EDA 基因突变检测，结果为少汗型外胚层发育不良携带者，即EDA基因 c.340C>T(p.Gln114*) 杂合变异。

此次妊娠，经本院伦理委员会审核，并根据孕妇要求和签署知情同意后，孕11周时抽取孕妇外周血10 ml，分离血浆和白细胞，提取血浆游离 DNA 和白细胞DNA，分别溶解于45 μl EB缓冲液保存备用。

孕11周彩超定位辅助绒毛活检取材，无菌条件下抽取绒毛20~30 mg，用无菌生理盐水清洗干净后，提取基因组DNA，保存备用。

以下实验过程均在本院完成。根据先证者和孕妇EDA基因c.340C>T(p.Gln114*)结果，在突变点上下60 bp范围内，分别设计朝向突变点延伸的 2 轮巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增特异性引物，分别标记为U引物和D引物，并设计了A组和B组检测引物。

依照游离DNA单分子标签检测（cell free DNA barcode-enabled single-molecule test, cfBEST）[1]对提取保存的DNA末端补平加A之后连接单分子标签接头，经 1X AMPure XP beads（Beckman 公司，美国）纯化之后，使用含有 index 的通用测序引物扩增构建预文库。取 100 ng预文库为模板，分别利用2组特异性引物和通用引物进行2轮巢式 PCR 靶向富集目标区域。将 2 组产物混合后，再用通用引物扩增，最终获得测序文库，并进行纯化与定量。根据定量浓度混合文库，利用 NextSeq CN500 测序仪，使用 75PE测序模式，每个样本上机 15 M reads。测序完成后，利用生物信息学方法计算母 / 胎儿基因型。

首先对 2 组引物进行了测试。根据 cfBEST 技术，2 组引物分别检测母亲和先证者白细胞 DNA，重复 5 次评价引物的特异性和重复性。5 次结果都显示孕妇的 EDA 基因c.340C>T(p.Gln114*) 为杂合变异，突变频率为 50%；先证者为半合子突变，突变频率为 100%，符合隐性遗传。A 组引物的杂合型频率为 51.2%，标准差为 1.96%，B 组引物的杂合频率为49.9%，标准差为1.26%。B组引物检测性能较好，更符合隐性遗传特征，可以作为候选引物对胎儿基因型进行无创检测。

根据检测位点的标记序列计数等位基因野生型模板数和突变型模板数，利用生物信息学算法确定胎儿基因型，并利用提取绒毛基因组DNA进行PCR扩增和一代测序，验证胎儿的基因型。将cfDNA＞10 ng，胎源性DNA含量＞ 5%，总分子数＞1 000用于质量控制。通过质控后计算等位基因比例和胎源性DNA含量，计算母/胎儿基因型。利用cfBEST技术成功检测到总分子数为1 555，突变分子数为764，突变频率为49.1%，胚胎DNA含量为14%，孕妇基因型c.340C>T杂合变异，胎儿基因型为正常野生型C/C，与绒毛活检取材产前诊断结果一致（图1）。电话随访，孕妇孕39周+1外院阴道分娩一男婴，出生体重3 400 g，外观未见异常。

讨论

1. 单基因遗传病及其产前诊断：单基因遗传病是指一对等位基因或一对同源染色体上单个基因发生变异导致的疾病或临床病理表现[2]，可分为常染色体病、性染色体病和线粒体病，呈显性或隐性遗传[3]。目前，多数单基因遗传病尚无有效的治疗方法，致死、致畸和致残率高，给家庭和社会造成了巨大负担[4]。产前诊断是预防此类患者出生的主要临床干预方法。传统的产前诊断方法是通过绒毛活检取材或羊膜腔穿刺获得胎儿样本进行产前诊断，但有流产、死胎等风险[5]。孕妇外周血 cfDNA 的发现是无创产前检测（non-invasive prenatal testing, NIPT）广泛用于胎儿常见染色体非整倍体筛查以及微缺失 / 微重复综合征分析的基础[6-7]，并改变了传统血清学筛查模式。随着研究的不断深入，cfDNA 也为胎儿单基因遗传病无创检测提供了理论可能，且多数单基因遗传病的无创产前诊断（non-invasive prenatal diagnosis, NIPD）方法正逐渐建立并符合临床实践要求[8-9]。

2. 外胚层发育不良：此观点是由Thurman于1848年提出，其后由Wedderhorn做了详细的描述。外胚层发育不良是一种以毛发、汗腺、牙等外胚层来源的组织发育不全或形态缺陷为特征的先天性遗传病，是由遗传因素引起的一组复杂性疾病症候群，临床罕见，发病率为1/100 000[10]，至今已发现外胚层发育不良有 200 多种不同的临床表型。临床上根据患者是否正常出汗又分为2型，即有汗型外胚层发育不良和少汗型 / 无汗型外胚层发育不良，其中以X-连锁的少汗/无汗型外胚层发育不全最为常见[11]。

少汗型外胚层发育不良是一种表型为无汗或少汗、毛发稀疏、牙齿形态异常、具有遗传异质性的疾病，发病率为7/100 000[12]。目前，世界范围内已报道的少汗型外胚层发育不良包括X连锁隐性、常染色体隐性和常染色体显性等遗传方式，相关基因突变 350 多种，其中X连锁隐性遗传突变约占84%[10]。EDA基因定位于Xq12-13.1，其突变是导致 X- 连锁的少汗型外胚层发育不良的重要原因。有研究显示，EDA 基因相关突变在 X- 连锁的少汗型外胚层发育不良患者中的检出率为 63%~95%。EDA 基因由 9 个外显子组成，其编码的蛋白质属于肿瘤坏死因子相关配体家族Ⅱ型跨膜蛋白，在外胚层发育中起重要作用。目前，外胚层发育不良患者缺少有效的治疗方法，病死率较高。为避免或减少再次生育该病患儿，需在基因水平上明确致病原因及其发病机制，提供正确的遗传咨询和产前诊断，减少出生缺陷[13]。

3. cfBEST技术：技术进步实现了单基因遗传病的NIPD应用于临床。NIPD对于单基因遗传病的思路包括存在 / 不存在和相对变异量/相对单倍体剂量分析策略[14-15]。基于存在/不存在原则的方法只能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，而无法进一步确定胎儿是否继承了母源突变，而相对变异量/相对单倍体剂量分析则可检测父母源的基因突变是否存在[16]。本研究采用的cfBEST 技术利用多重半锚定巢式 PCR 原理，经过 2 次 PCR 测序文库，实现了对DNA片段的基因突变检测。cfBEST 技术具有以下特点：（1）特异性引物靠近目标位点，结合锚定引物，最大限度利用检测点位于末端的模板分子，减少引物扩增偏差；（2）以巢式PCR的形式设计2轮特异性引物扩增，提高检测特异性；（3）原始DNA分子连接7 nt简并碱基 barcode接头，进行单分子计数；（4）独特的去除噪音设计，提高检测准确性[1]。该技术具有以下优点：（1）容量大，同时检测多种突变类型，位点数达到800个以上；（2）检测等位基因频率准确，精确度高；（3）操作简单快捷、稳定性高。cfBEST 技术能够应用于无创单基因疾病检测；肿瘤突变负荷检测；超低频突变检测；器官移植免疫排斥检测，但该技术不能检测大片段缺失 / 重复以及当相对突变剂量处于临界值时，还需要有创产前诊断方法进一步确认[1]。

另外，单基因遗传病 NIPT 应用于临床的前提是准确、简便，可以一次性检测多种单基因遗传病及多种突变类型。随着测序技术与生物信息统计学的快速发展和不断完善，NIPD单基因遗传病的方法不断完善，未来将会应用于临床实践。本研究利用cfBEST技术从血浆样本中成功检测出1例曾生育过外胚层发育不良患儿的孕妇胎儿基因型，与绒毛活检取材基因诊断结果一致，验证了cfBEST技术临床应用的可行性，说明cfBEST技术可用于单基因遗传病点突变的诊断。

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来源：中华围产医学杂志 

作者：代鹏　赵干业等