单细胞测序新方法：转座子介导的单细胞“名片”技术

来源：BioArt

转录因子调节基因表达模式促进细胞状态的特化，对于在发育过程中维持细胞多能性、细胞命运选择以及胚胎发生过程非常关键【1,2】。全面揭示发育阶段和稳态阶段转录因子的结合模式将为理解在正常生理和异常病理条件下细胞多样性是如何产生和维持的提供全面的见解。单细胞RNA测序 (Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq) 已成为表征复杂组织和生物细胞多样性的高通量实验方法【3-5】。虽然有很多新兴的单细胞测序方法逐渐进入大家的视野同时也在不断被优化，但是目前关于联合检测转录组和转录因子结合位点的单细胞测序方法还未见报道。

为了填补这一部分的技术空白，2020年7月24日，圣路易斯华盛顿大学医学院Robi D. Mitra研究组发文题为 Self-Reporting Transposons Measure Single-Cell mRNA and Transcription Factor Binding，介绍了一种在不同细胞系以及小鼠体内可以同时捕捉基因表达和转录因子结合位点的单细胞测序方法称为“单细胞名片”（Single cell calling cards）。

目前研究转录因子结合的最普遍的方法是染色质免疫共沉淀测序法（Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq），DamID技术也可以通过检测内源甲基化腺嘌呤的方法恢复转录因子结合的信息【6,7】，但是DamID在单细胞水平发挥作用的报道也只有关于核纤层相关区域的研究。为了达到同时在检测基因组与转录因子结合位点的目的，Mitra研究组先前开发了一种叫做“转座子名片”的方式来检测检测转录因子的表达【8-10】。该转座子名片系统主要包含两个组分：转录因子与转座酶的融合蛋白以及一个携带报告基因的转座子。转座酶融合蛋白会将转座子放置在靠近转录因子结合位点的区域，而后会被从基因组DNA中扩增出来然后进行高通量测序。这就相当于转座酶会在其到过的基因组位点出给出一个“名片”也就是转座子，随后通过这个名片对转录因子结合位点进行访问，实现高通量测序找出转录因子结合模式的目的。在哺乳动物细胞中，作者们曾使用piggyBac转座酶【11】融合转录因子SP1的方式对SP1的结合位点偏好性进行了探究。但是目前此方法只能应用于数以千计的细胞而不能达到单细胞测序的水平。

为了将单细胞测序与转座子名片方式进行结合，作者们开发出了一种基因组插入位点由mRNA决定的转座子元件。作者们通过移除报告基因的多聚腺苷酸信号创造了一个piggyBac自我报告转座子（Self-reporting transposons，SRT）体系（图1）。RNA聚合酶II转录SRT转座子报告基因，并通过末端重复序列进入转录因子结合位点侧翼基因组序列。SRT转座子通过在报告基因的3’非翻译区域中发现的独特基因组序列来“自我报告”它们的位置（图1）。SRT来源的转录本包含转座子-基因组连接区域，因此可以通过转座子插入精准地对碱基位置进行确认。作者们发现RNA为基础的转座子恢复与DNA为基础实验方法相比基因组信息敏感性更高而且更没有偏向性，因此作者们决定采用RNA为基础的实验方案对转座子插入的基因组进行恢复。

图1 单细胞名片测序原理及流程

先前有研究发现单独的piggyBac转座酶在超级增强子区域会有偏向性插入，作者们发现的确未受转录因子调控的piggyBac单独转座会检测到BRD4结合的超级增强子。除此之外，作者们还发现未融合转录因子的piggyBac与Tn5反映的开放染色质区域相符合，但是piggyBac还能够反映一些染色质关闭区域的信号，因此可能会带来更多的信息而不完全等同于ATAC-seq。

在将piggyBac SRT转座子与转录因子相融合后，作者们发现单细胞名片系统可以广泛鉴定出不同细胞系中不同转录因子的结合位点。比如转录因子SP1，已知具有在转录起始位点结合的偏好性以及CpG岛去甲基化过程中发挥重要作用。在与piggyBac SRT融合后，作者们观察到在转录起始位点、CpG岛以及未甲基化的CpG岛区域SP1结合信号有着明显地富集。除了SP1，作者们还使用单细胞名片系统在HepG2细胞中检测了先锋因子FOXA2的结合区域。FOXA2对于正常肝脏发育以及驱动肿瘤细胞核心转录网络中具有关键作用。作者们在单细胞名片系统测序结果中发现，与前人的研究一致的是FOXA2特异性富集在其基因组结合基序处。这些结果均表明该单细胞名片系统的精确性与稳健性。除了将该单细胞测序技术在多种不同细胞系中进行检测，作者们还将该单细胞名片系统应用于小鼠体内。作者们发现在小鼠大脑皮层中单细胞名片系统可以揭示出细胞特异性BRD4结合信息。

图2 单细胞名片在细胞水平以及体内的应用

总的来说，Mitra研究组工作将新颖的遗传学元件piggyBac SRT转座子应用于单细胞测序检测转录因子在基因组上的结合位点，同时实现了检测基因表达与转录因子结合两种实验需求，该技术在多种细胞系以及小鼠体内均能稳健地促进转录结合信息的捕捉，将大大扩展可供使用的单细胞测序工具。