液相分离：药物靶点新宠

来源：BioArt
撰文 | 小肉包责编 | 雪月

细胞内液相分离现象与细胞内多种生物过程有关，目前已进入制药公司的研究范围。

细胞需要在时间和空间上协调各种各样的生化反应。液-液相分离可以加速反应或减缓反应。这些油滴可以合并和分离，就像油醋汁沙拉酱中的油滴一样。（图片来源：Shutterstock）

液相分离的发现
Clifford P. Brangwynne在显微镜下观察秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎细胞时，他看到了细胞内部许多 “发光” 的小点。这些小点在细胞中不断地出现、合并、分离，最终消失。Brangwynne意识到，这些小点应该就是之前科学家们提出的p颗粒，由RNA和蛋白质组成。这些小点在显微镜下能折射光，说明其不是固体，而表现为液体。而这也解释了细胞内部是如何有组织且互相独立地发生生化反应的——通过相分离成小液滴。“突然之间，一切都说得通了。” Brangwynne兴奋地说。
Brangwynne观察到的这种现象被称为”液-液相分离(LLPS)”。在LLPS中，一种混合均匀的液体可以LLPS成两层，就像混合好的香醋沙拉酱逐渐LLPS成醋层和油层一样。
这种现象事实上早已进入科学家们的视野。20世纪40年代以来，材料学家们发现在聚合物中存在这种液-液相分离(LLPS)的现象，并且这种现象可以用来控制聚合物的结构。”尽管RNA、蛋白质也是一种高分子聚合物，但是没有人意识到生物系统中也可能存在这种现象”。德克萨斯大学西南医学中心的生物物理学家 Michael Rosen 如是说。
在2009年，Brangwynne在SCIENCE发表了他的开创性发现（DOI：10.1126/Science. 1172046）。与此同时，Rosen也从聚合物的LLPS研究转移到生命系统，并且他发现，在细胞骨架形成过程中，三种相关的蛋白质将融合在一起形成液滴。
从那时起，科学家们发现 LLPS 几乎存在细胞内的任何地方。LLPS把蛋白质、 RNA 和其他大分子聚集在一起，在需要的时间和地点发生反应，就像细胞器一样，唯一区别就是没有膜包被。更重要的是，Brangwynne 说，“这些液滴通过将反应物浓缩在一个很小的体积中来加速化学反应。”
一旦蛋白质或其它分子达到一定浓度，它们就会发生LLPS，从而隔离无关的分子。可以说，LLPS是细胞的化学变阻器，使细胞能够根据不断变化的环境条件对一系列反应进行微调。
相似的成分聚集在一起加速生物学反应（有点类似于相似相容），近来，学者们发现LLPS在许多生理过程中扮演重要角色，发挥着许多生物学功能。LLPS一旦发生异常，将会导致多种疾病产生。因此，LLPS研究目前已经成为医药学家们研究的重点。在疾病发生过程中，如何纠正异常的LLPS过程是未来的挑战。
液相分离的研究史
1899年，基于海胆卵的研究，哥伦比亚大学的细胞生物学家Edmund Beecher Wilson在美国海洋生物实验室发表了题为”原生质的结构”的演讲。Wilson认为，细胞内部（后被命名为细胞质）是不同液体形成的一种良好乳状液，其中有悬浮的液滴。尽管Wilson在科学界的地位很高，但是当时没有人理解他的观点。
在1940年，材料学家注意到，他们研究的许多单体呈现多价，在溶液中很容易与其它分子形成弱共价键。因此，这些单体可以在溶剂中保持完全溶解，直至到达饱和点。到达饱和点后，它们会在溶液中析出小液滴，即出现LLPS现象。单体的多价性多高，达到饱和点的浓度就越低。
在接下来的60年里，这种现象在工业界里得到广泛应用，用于分离聚合物和控制聚合物的形态。尽管聚合物的一些性质和蛋白质、核酸等生物聚合物有相似之处，但是生物学家通常不会涉猎工业化学过程，而化学家们则不会花精力去学习细胞内的分子机制。
直到2008年，细胞内的LLPS奥秘才被Brangwynne和Hyman揭示出来。具有讽刺意义的是，Brangwynne是在109年前Wilson发表演讲的同一个海洋生物实验室授课时突然迸发出的灵感。当时，两位学生发现受精后的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎细胞中有许多发光的小点。
回到德国的马克斯普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所（MPI-CBG）后，他们开始深入研究这个现象。应用物理学出生的Brangwynne当时师从Hyman教授，在马克斯普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所作博后研究。他逐渐意识到只有LLPS可以解释细胞内这一迷人的现象。
显微镜下秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的胚胎细胞中有许多发光的小点。（图片来源：Science）
LLPS在生化反应中的作用

Brangwynne说：“这个现象是汇集天时地利人和才发现的。”他和Hyman最终发现 p 颗粒在单细胞胚胎内部周围可以自由移动。胚胎细胞分裂时，极性蛋白 PAR-1和 PAR-2会集中在胚胎的一侧。当蛋白质达到足够高的浓度时，就会形成p 颗粒。然后，这些颗粒迅速聚集在细胞的一侧，在分裂时，进入其中一个子细胞。它们的存在引导胚胎发育成不同的组织，最终成为成虫。
这个突破不仅推进了线虫发育的机制研究，更给细胞内各种生化过程带来了颠覆性的影响。北卡罗来纳大学教堂山分校研究LLPS的定量细胞生物学家 Amy Gladfelter说：” 这个发现让生物学家用全新的角度观察细胞内的生命过程。”
同年，Rosen也意识到LLPS在生物学中可能扮演重要角色。他的团队发现构建细胞骨架，三种相关的蛋白质会形成液滴。接着，Rosen从蛋白质的结构角度考察了LLPS的影响因素。他发现，蛋白质拥有越多的重复序列，即蛋白质的效价越高，聚集成液滴所需要的浓度就越低。这与70年以前聚合物LLPS的规律一致。Rosen的发现表明，蛋白质的多价性在LLPS形成过程中是关键的因素之一。
他认为这个研究结果意义非凡，然而却被一些顶级期刊拒收，编者们认为蛋白质和聚合物表现出相似的行为是显然的，这没有什么好稀奇的。然而这就是问题的关键，尽管这种LLPS很好理解，但生物学界却没有人能证明。经过了四年多的时间以及五轮返修，2012年，Rosen的研究结果终于发表在Nature杂志。（Nature， DOI： 10.1038/nature10879 ）
Rosen发现蛋白质多价性是形成LLPS的关键，后来学者们证实了这一点，并且最终确定了一种特定类型的关键蛋白质结构。
正常来讲，蛋白质二级结构主要形式包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。其他非结构化区域，又被称为低复杂度域。学者们发现，含有低复杂度域的蛋白质特别容易发现LLPS。
波士顿大学药理学家Benjamin Wolozin，在过去的十年里，深入研究了低复杂度领域的分子相互作用，包括那些促进LLPS的结构。他发现，这些低复杂结构域中的氨基酸残基之间存在弱相互作用，例如精氨酸的偶极残基与酪氨酸的芳香残基存在盐桥、 π- π堆积以及阳离子- π相互作用。这些相互作用力说弱也不弱，因为它们足以把蛋白质的两个部分拉到一起；说强也不强，因为稍有外力就能轻易破坏，就像便利贴一样。这使得大分子聚集成液体形式，而不是固体形式。
不久之后，越来越多的研究报道LLPS相关的工作，学者们发现LLPS与生命体的许多基本生物功能有关。例如，细胞核内的核仁也是一种LLPS现象；DNA转录过程相关的蛋白机器也聚集成液滴形式。圣犹大儿童研究医院的结构生物学家 Tanja Mittag 说：“它们的功能类似于细胞器。液滴将合适的分子聚集在一起，能促进化学反应，因为液滴中高浓度的反应物会使反应速度加快，大大快于分子在稀释的细胞质中随机相遇的速度。”
Mittag 还说：“这些液滴的形成与反应物浓度紧密相关，浓度的微小变化就能触发液滴的形成，就像一个开关被打开了一样。”
然而，目前尚未清楚，这个LLPS过程受什么驱动。另外，为什么有些疾病中，形成的液滴最后变成了固状？
当蛋白质(蓝色和黄色)和 RNA (红色)达到足够高的浓度时，它们可以在细胞质中自发地聚集成小滴。（图片来源：Cell）
液相分离与疾病

神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化（ALS）表现为运动神经元退化并死亡，导致患者不能行走、说话，最终甚至不能呼吸。Wolozin对ALS十多年的研究发现LLPS异常在 ALS 的发展中起着关键作用。在正常情况下，运动神经元受到热、化学物质和其他环境因素的压力时，会形成应激颗粒，这种颗粒呈液滴状，可以随着环境的变化而消失；然而，在ALS 患者中，这种颗粒呈固体状，不会消失。
2010年，Wolozin等科学家发现，RNA结合蛋白TDP-43是应激颗粒的关键组成部分(PLOS One，DOI：10.1371/journal.pone. 0013250)。ALS患者中，TDP-43往往存在突变，与其它分子的”粘性”增加，因此聚集成固体。
除了ALS，越来越多的疾病被认为与LLPS异常有关，因此纠正LLPS异常可以治疗ALS等神经退行性疾病甚至癌症。这也是为什么许多制药公司，包括默克这样的巨头医药公司以及初创小型企业Dewpoint Therapeutics和Aquinnah Pharmaceuticals，在过去几年对LLPS产生了浓厚兴趣的原因。
对于药学家来说，理解LLPS在细胞中发挥的功能至关重要，不仅仅因为它是治疗一些疾病的靶点，更因为它本身就与药物的作用机制有关。最近，刊登在Science的学术论文表示，LLPS过程能抑制癌症药物扩散到整个细胞，以至于药物集中在不同的部位。
默克公司的化学生物学主任 Jason Imbriglio 说，研究LLPS的挑战在于开发能识别液滴动态变化的方法和工具。Dewpoint Therapeutics的首席科学官Mark Murcko 说，不管是基础研究还是临床应用研究，LLPS需要一套完全不同于传统生物研究的方法。
“我们原先以为分子在细胞质中是自由游走的。但是现在发现，某些特定分子在LLPS的作用下倾向于聚集一起。” Murcko 说。
相信在不久的未来，纠正液相分离异常的难题终将被破解，一些疾病也终将会被治愈！