液体橡皮泥集成等电聚焦的小型化蛋白质分析平台

来源：ACS美国化学会

西安交通大学生命科学与技术学院的李菲教授与西北工业大学物理科学与技术学院的李晓光副教授合作，针对在即时检测领域发展小型化、快速蛋白质分析平台的需求，基于具有良好透光性、开放性、可塑性和可切割性的液体橡皮泥材料构建了等电聚焦体系，开发了一种具有样品预处理功能且可灵活与多种检测方法结合的小型蛋白质分析平台。该平台可实现在40分钟内对蛋白质的分离，分辨率达到0.03 pH单位。并将液体橡皮泥等电聚焦平台与比色检测和质谱检测结合，进一步实现了对尿液中尿微量白蛋白的定量检测及糖尿病标志物AMBP的鉴定。相关研究结果近期以封面文章发表在Analytical Chemistry期刊上。   

蛋白质是重要的疾病标志物大分子，蛋白质分析在疾病诊断和监控及精准医疗等领域发挥着重要作用。由于生理样品中蛋白质组成复杂，蛋白分析中需要对样品进行预处理。传统基于毛细管、微通道或凝胶的预处理技术为蛋白质的预处理提供了基体，但这些方法依赖较大的仪器，不利于即时检测，并且对后续目标蛋白质的收集和进一步通过添加反应试剂进行蛋白质的分析造成了阻碍。因此，需要发展小型化且可灵活与多种检测方法结合的集成样品预处理功能的分析平台，用于蛋白质的现场、快速检测。

近日，西安交通大学生命科学与技术学院的李菲教授团队与西北工业大学物理科学与技术学院的李晓光副教授团队合作，将由疏水性SiO₂纳米颗粒包封的、同时具有透光性、开放性、可塑性、可切割性的软体材料——液体橡皮泥——与等电聚焦技术集成，搭建了一种小型化的可同时实现蛋白质分离与富集的新型蛋白质分析平台(图1a)。该平台中，等电聚焦可实现蛋白质的同时分离与富集(图1b)。通过等电聚焦分离蛋白后，由于液体橡皮泥良好的透光性，可采取直接在液体橡皮泥中柱成像的方式对分离后的蛋白质进行分析(图1c)。另外，基于液体橡皮泥的可切割性和开放性，利用疏水处理后的刀片选择性地收集了目标组分到独立的液体弹珠中，由于液体弹珠外围包封的疏水性SiO₂纳米颗粒非常薄，可方便地刺破疏水性纳米颗粒薄膜提取液体弹珠内的蛋白质，用于后续分析或向液体弹珠内部滴加反应试剂的方式在液体弹珠内分析目标蛋白自组分(图1d)。

图1. 基于液体橡皮泥等电聚焦的蛋白质分析平台的构建和应用示意图。(a)液体橡皮泥等电聚焦装置的示意图，(b)基于液体橡皮泥等电聚焦装置分离蛋白质的原理图，(c)等电聚焦后直接通过对液体橡皮泥柱成像检测目标蛋白质组分的示意图，(d)等电聚焦后收集目标蛋白至独立的液体弹珠后，通过显色、侧流试纸或质谱结合的目标蛋白质组分的定量分析示意图。

首先，研究人员为优化液体橡皮泥等电聚焦体系，探究了溶液粘度、电场强度和分离通道长度等参数对蛋白质等电聚焦分离效果的影响(图2)。基于优化的实验条件，得到了液体橡皮泥等电聚焦体系的形成在2.05~10.35的线性pH梯度范围(图2d)，为后续蛋白质分析过程中选择性收集目标蛋白奠定了基础。

图2. 液体橡皮泥等电聚焦蛋白质分析平台的实验条件优化。(a)羟乙基纤维素浓度、电场强度与液体橡皮泥等电聚焦体系分离分辨率之间的关系。(b)羟乙基纤维素浓度、电场强度与液体橡皮泥等电聚焦体系分离时间之间的关系。(c)分离通道长度与液体橡皮泥等电聚焦体系分离分辨率和分离时间之间的关系。(d)分离通道内形成pH梯度的表征结果。

之后，研究人员采用细胞色素C、牛血红蛋白和藻蓝蛋白为模型蛋白，研究了基于液体橡皮泥等电聚焦体系分离蛋白的过程，验证了液体橡皮泥等电聚焦体系分离蛋白质的能力(图3a)，整个分离过程在40分钟内完成。为表征液体橡皮泥等电聚焦体系分离蛋白的分辨率，从成人血细胞中提取了人血红蛋白用作等电聚焦的样品，实现了等电点相差0.03 pH单位的正常血红蛋白与糖化血红蛋白的分离(图3b)。进一步将稀释十倍后的人血清用作等电聚焦的样品，对人血清中高丰度的7种蛋白进行了分离，取得了良好的分离效果(图3c)，证实了液体橡皮泥等电聚焦体系处理实际生理样品的能力。另外，对液体弹珠内的目标蛋白质组分采取了乙酸乙酯萃取包裹在液体弹珠外围SiO₂纳米粒子的方法进行了收集，得到的液体橡皮泥等电聚焦体系的蛋白质样品回收率超过85%(图3d)，高效的样品回收为液体橡皮泥等电聚焦与后续的蛋白分析技术结合提供了条件。

图3. (a)基于液体橡皮泥等电聚焦体系的标准蛋白的等电聚焦过程。(b)基于液体橡皮泥等电聚焦体系分离人血红蛋白的结果。(c)基于液体橡皮泥等电聚焦体系分离人血清后的SDS-PAGE图谱。(d)基于藻蓝蛋白、牛血红蛋白表征的液体橡皮泥等电聚焦体系的样品回收率。

最后，研究人员验证了液体橡皮泥等电聚焦体系与比色分析、侧流试纸和质谱结合，应用于实际样品中蛋白质分析的能力。包括结合比色法实现了糖尿病人尿液中微量白蛋白的定量检测(图4a,b)，结合试纸实现了白蛋白的检测(图4c)，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)实现了糖尿病标志物α-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP)的鉴定(图4d)。该液体橡皮泥等电聚焦装置作为小型化的蛋白质分析平台在现场、快速检测领域显示出应用潜力。通过集成电动预处理功能为扩展液体橡皮泥和液体弹珠等软体材料作为分析平台的应用提供了新的策略。

图4.(a)基于液体橡皮泥等电聚焦体系的白蛋白定量校准曲线。(b)基于液体橡皮泥等电聚焦体系分析临床尿液的结果和临床分析结果的对比图。(c)基于试纸检测白蛋白是否经过液体橡皮泥等电聚焦的对比图。(d)MALDI-TOF-MS结合液体橡皮泥等电聚焦分析临床尿样中AMBP谱图。