Angew：控制释放近红外荧光染料Nile Blue用于实时监测细胞衰老

来源：CBG资讯

细胞衰老是维持机体动态平衡所必需的细胞周期停滞状态，其主要特征包括细胞形态的改变、浓缩核染色质病灶的出现以及p53、p21等肿瘤抑制蛋白的过度表达或激活。就目前而言，检测细胞衰老的主要方式之一是使用荧光探针测量衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性，而该方法仅适用于体外研究，无法应用于体内细胞衰老的检测。

近日，西班牙瓦伦西亚大学的Ramón Martínez-Máñez和Félix Sancenón课题组基于六糖半乳糖和食品药品监督管理局（FDA）批准的有机染料尼罗蓝（NB）合成了一种介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）—S3，其在体内外实现了细胞衰老的检测。相关成果以“Real time in vivo detection of cellular senescence through the controlledrelease of the NIR fluorescent dye Nile Blue”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202004142）。

MSN由于其良好的生物相容性和易于功能化等特性被广泛用于药物递送系统。因此，作者选择MSN作为纳米载体，将高浓度NB染料负载于其表面，最后包覆半乳糖增加门控能力，从而合成探针S3。NB是一种芳香族平面荧光团，在高浓度或密闭空间中形成非发射性的π堆积聚集体，荧光淬灭。在衰老细胞中过度表达的SA-β-Gal的作用下，半乳糖水解产生半乳糖残基，NB释放，近红外荧光发射增强。另外，作者在SK-Mel-103（人黑色素瘤）细胞、4T1（鼠系乳腺癌）细胞甚至BALB/cByJ小鼠中进行了细胞衰老的检测（Figure 1）。

首先，作者通过高倍透射电子显微镜（HR-TEM）观察了S3中的介孔结构（Figure 2a and 2b）。为了研究NB在S3孔内的淬灭情况，作者比较了在相同NB浓度下，游离的NB溶液与S3悬浮液的荧光强度，发现游离的NB溶液明显具有更强的荧光发射（Figure 2c）。进一步的，作者探究了不同浓度NB溶液在666 nm处的荧光发射强度，用于证明高浓度溶液中NB的荧光淬灭现象。实验结果表明，在NB浓度大于10-3 M时荧光强度极低，而当浓度低于10-4 M时荧光才逐渐增强（Figure 2d）。除此之外，作者探究了在β-Gal酶存在与否的情况下NB从S3的释放过程，发现在β-Gal酶的存在下NB才得以释放，这可能是因为β-Gal酶水解了半乳糖中的糖苷键，降低了介孔结构的致密性，促使NB的释放（Figure 2e）。

接下来，作者用5 µM palbociclib（一种抑制DNA复制并诱导细胞周期阻滞的CDK4/6抑制剂）诱导SK-Mel-103和4T1细胞衰老（衰老状态经X-Gal染色验证），探究S3对衰老细胞的体外靶向性（Figure 3a，3e，3i and 3m）。共聚焦成像表明经S3孵育的衰老细胞显示出强烈的荧光信号（Figure 3g and 3o），而正常细胞则只呈现微弱的荧光（Figure 3c and 3k）。另外，用等剂量的游离NB处理细胞，也获得了类似的实验结果（Figure 3d，3h，3l and 3p）。荧光半定量结果表明，与正常细胞相比，用S3处理后的SK-Mel-103衰老细胞的荧光发射强度增加7倍，4T1细胞的荧光强度增加10倍（Figure 3q and 3r）。

最后，作者在药物诱导衰老用于治疗乳腺癌的小鼠体内验证了S3对细胞衰老的检测效果。小鼠分为以下四组：（A）带有4T1肿瘤的小鼠；（B）用S3处理带有4T1肿瘤的小鼠；（C）仅给予palbociclib的小鼠；（D）用palbociclib和S3处理后带有4T1肿瘤的小鼠。实验结果表明A、B、C组小鼠在肿瘤部位几乎无荧光信号，而D组则观察到强烈的荧光信号（Figure 4a），且荧光信号在注射纳米粒子24-36小时后达到峰值，荧光半定量分析进一步说明了该结果。随后，作者解剖并分离各组小鼠的血液、脾、肺、肾、肝脏和肿瘤，经X-Gal染色证实了palbociclib处理后小鼠肿瘤的衰老（Figure 4c）；经小动物成像系统及荧光半定量分析证实了用palbociclib处理后小鼠肿瘤的强荧光发射（Figure 4c and 4d）。

总而言之，作者基于纳米载体MSN，将高浓度NB染料负载于其表面，最后包覆半乳糖增加门控能力，合成了探针S3，用于检测体内细胞的衰老。此类高选择性、高灵敏性的OFF-ON型探针为各种老年相关疾病中的追踪治疗提供了一定的基础。