CRISPR/Cas9基因编辑技术

来源：分子生物应用

CRISPR/Cas9基因编辑系统，主要利用Cas9核酶特异性切割DNA技术，实现基因编辑。而Cas9的特异性切割需要特异性的sgRNA的指引。实现对基因组中某种基因的特异性编辑，首先需要设计靶基因特异性的sgRNA序列，下图红色位置即靶基因特异性的序列（20nt的RNA序列），该序列可以与基因的另一条链特异性结合，从而实现sgRNA的特异性指引，Cas9核酶在sgRNA的指引下切割PAM（NGG）前3个碱基的磷酸二酯键，实现DNA双链的断裂（DSB）。而细胞中的基因发生双链断裂后，会启动细胞的修复功能：同源重组（HDR）和非同源重组（NHEJ）。修复后在断裂的位置就会出现各种错配，基因重排，从而实现基因编辑。

图1. CRISPR基因编辑原理

特异性sgRNA引导下，Cas9蛋白定点切割双链DNA，实现基因双链断裂。

要将培养细胞中某种基因编辑主要包括：1）CRISPR编辑载体构建（表达获得特异性sgRNA和Cas9酶）；2）将构建好的CRISPR载体导入细胞中（可利病毒感染的方法）；3）鉴定编辑是否成功；4）挑选编辑成功的细胞扩大培养。

1.sgRNA设计

sgRNA计的网站比较多，张锋老师实验组总结了sgRNA设计工具如：https://zlab.bio/guide-design-resources，可任选一种进行设计。

2.CRISPR载体构建

合成sgRNA对应的两条单链DNA，两条互补的单链DNA退火形成双链DNA，然后将双链DNA连接到CRISPR相关载体。

3.慢病毒包装感染目的细胞系

构建好的CRISPR载体含有sgRNA转录部件和表达Cas9的基因序列，此外这些载体中通常也含有慢病毒包装所需的所有原件。可根据具体的CRISPR慢病毒包装载体进行病毒包装。需要注意在病毒包装前需要先进行sgRNA有效性验证，将构建好的载体转染至目的细胞系，然后提取DNA验证是否有编辑效果。

将有效的sgRNA进行慢病毒包装与感染目的细胞系。最后挑选编辑成功的目的细胞扩大培养。

小鼠基因编辑是通过编辑受精卵实现特定基因编辑。首先。通过体外转录获得表达Cas9蛋白的mRNA和引导作用的sgRNA，然后将Cas9蛋白的mRNA和sgRNA显微注射至受精卵细胞，受精卵移植到假孕雌鼠中，然后筛选子代进行验证。

小鼠基因编辑分为Knockout（敲除）和Knockin（插入）。CRISPR/Cas9系统是通过Cas9的特异性切割实现基因双链DNA断裂，而Knockout是通过NHEJ非同源重组修复实现的基因失活；Knockin是通过HDR同源重组实现的外源基因的插入或定点突变。

图2.小鼠受精卵细胞CRISPR/Cas9基因编辑

将Cas9蛋白mRNA和sgRNA或外援ssOND（插入片段）片段（或质粒DNA）显微注射单细胞时期的受精卵细胞，单细胞受精卵过夜培养至双细胞受精卵，然后移植到假孕雌鼠子宫。在HDR修复下实现基因插入，在NHEJ作用下实现基因失活。最后筛选成功编辑的小鼠。

参考文献：

1. Single-Step qPCR and dPCR Detection of Diverse CRISPR-Cas9 Gene Editing Events in Vivo

2. Gene editing in mouse zygotes using the CRISPR/Cas9 system