叶海峰团队利用“光刀”实现基因时空特异性的精准编辑

来源：BioWorld

近年来，CRISPR-Cas9技术作为新兴基因编辑技术，在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命。作为第三代基因编辑技术，相比于第一代基因编辑技术锌指样核酸酶（ZFNs）和第二代基因编辑技术转录激活样效应子核酸酶（TALENs)，既保证了良好的打靶效率，又更加简便、快捷、高效，且成本也大大降低，广受科学界瞩目。该技术几乎可以在任何物种的任何位置发挥作用，为研究细胞复杂的生物学功能提供了极其便利的技术手段，为解决人类基因疾病带来了希望和光明，成为生命科学史上具有里程碑意义的生物技术。

但在享受该技术带给我们便利的同时，也不得不正视其缺点。客观地说，无论在基础研究中还是在临床治疗上，该技术的应用仍然存在很多较难解决的问题，包括：（1）由于Cas9表达的不可控性导致的脱靶效应，这会带来严重、不可预估的副作用；（2）无法实现时空特异性的精准编辑。针对上述问题，亟需开发一种可时空特异性精准控制的CRISPR-Cas9系统，即给传统的CRISPR-Cas9系统加上可时空特异性控制的光控“开关”，只有“开关”打开时，系统才能工作。这样做的目的在于不会让Cas9核酸酶持续高表达，只有当我们需要它的时候，它才会产生，从而极大地降低脱靶效应，同时利用光本身的优势实现时空特异性的精准控制。
2020年7月10日，华东师范大学生命科学学院、上海市调控生物学重点实验室、华东师范大学医学合成生物学研究中心研究员叶海峰团队在 Science Advances 杂志上发表了题为：Engineering a far-red light–activated split-Cas9 system for remote-controlled genome editing of internal organs and tumors 的最新研究成果，巧妙地将合成生物学、光遗传学、基因编辑多学科技术交叉融合，开发了一个远红光调控的分割型split-Cas9基因编辑系统（简称FAST系统）。
该系统以较低强度的远红光外部照射作为控制手段，借助于远红光本身的组织通透性优势，克服了目前化学小分子调控以及蓝光调控CRISPR-Cas9系统的缺点，具有远程无痕、低本底泄露、低脱靶效应、低毒性等体内应用优势，能够在时间和空间上特异性的精准控制体内深层组织和器官的基因编辑。

研究者利用合成生物学的设计原理，将红细菌中响应远红光的蛋白BphS，链球菌中的转录因子BldD以及酿脓链球菌中的Cas9核酸酶经理性设计、组装和重编程构成了远红光调控的分割型split-Cas9基因编辑系统（far-red light–activated split-Cas9 system, FAST），其中Cas9核酸酶被分为N端（第1-713个氨基酸）和C端（第714-1368个氨基酸）两部分，分别融合了来自热纤维梭菌的一对能够自发相互结合的蛋白Coh2和DocS（图1）。
图1. FAST系统的工作原理图。A，融合了Coh2蛋白的N端Cas9与融合了DocS蛋白的C端Cas9可以在Coh2和DocS蛋白的自发相互作用下形成完成的Cas9核酸酶。B，DocS和C端Cas9融合蛋白由人类巨细胞病毒启动子（PhCMV）强启动表达，N端Cas9和Coh2融合蛋白由远红光诱导表达。当两种融合蛋白均表达完成时，N端Cas9和C端Cas9可以在Coh2和DocS的自发相互作用下结合到一起，形成完整的有功能Cas9核酸酶，进而在sgRNA的引导下发挥基因编辑功能。

首先，研究者们在细胞水平测试了FAST系统的基因编辑功能。实验结果显示，FAST系统在LED发射的低强度远红光照射下可以诱导细胞内单个或多个内源基因的编辑，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），且黑暗情况下几乎无本底泄露。FAST系统在多种细胞中均显示出可调控的基因编辑效果，并具有很好的光照强度和时间依赖性，以及高度的时空特异性（图2），为研究FAST系统在动物体内的可调控基因编辑能力奠定了基础。
图2. FAST系统的表征测试。FAST系统介导的时空特异性基因编辑。
随后，研究者们将FAST系统通过流体动力学尾静脉注射方式递送至tdTomato转基因报告小鼠（Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato) Hze，含loxP-STOP-loxP-tdTomato cassette]的肝脏中，只有当Cas9对loxP-STOP-loxP终止信号区的DNA进行切割编辑后，tdTomato红色荧光蛋白才能表达出来。因而，通过观察小鼠肝脏部位tdTomato的表达情况可以得知肝脏细胞中DNA被编辑的情况。肝脏器官成像和组织冰冻切片结果显示，与黑暗组相比，光照组小鼠肝脏中的tdTomato基因有显著的表达（图3）。

图3. FAST系统在tdTomato转基因模型小鼠体内的基因编辑情况。A，FAST系统在tdTomato转基因模型小鼠体内实验的时间进程安排以及作用原理图。B，肝脏成像图。C，肝脏成像相对荧光强度统计值。D，肝脏组织冰冻切片荧光成像图。

最后，研究者们在异种移植肿瘤（A549）模型小鼠中验证了FAST系统的疾病治疗应用潜力。将FAST系统递送至小鼠体内的肿瘤中，通过LED远红光的照射使得FAST系统切割肿瘤致癌基因PLK1即可显著抑制肿瘤的生长。上述体内研究结果均证明FAST系统中使用的LED来源的低强度的远红光照射具有良好的组织穿透力和体内应用效果。

总之，FAST系统不仅在体外培养的多种细胞中实现了内源基因的光控基因编辑，而且可以对动物体内的成体细胞实现光控基因编辑。研究人员还利用该系统对小鼠肿瘤中的致癌基因进行编辑，实现了光控抑制肿瘤生长的效果。
这项研究作为一个精准、时空可控的基因编辑技术平台，提供了一种新型可控的基因编辑工具，扩展了当前CRISPR-Cas9基因编辑工具箱，有望应用于基因功能的研究，以及遗传病、肿瘤等多种疾病的精准可控治疗。
叶海峰研究员（左）为该研究论文的通讯作者，博士研究生于袁欢（右）为该研究论文的第一作者。
本研究成果是在叶海峰课题组近年来的光遗传学研究基础之上取得的进一步研究成果。2017年，该课题组在Science Translational Medicine期刊上发表了一篇研究文章（通过绿茶治疗糖尿病，华东师大最新研究登上Science子刊封面），文章报道了一种远红光（730 nm）调控的转基因表达控制系统，并实现了智能手机超远程控制光敏细胞释放胰岛素治疗糖尿病的目标，颠覆了传统口服和注射降糖药物控制血糖的方法。2018年，该课题组在美国科学院院刊PNAS上发表研究论文，他们将远红光调控转基因表达控制系统与CRISPR-dCas9技术相结合，开发了远红光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录激活装置（FACE），可实现表观遗传操控以及诱导干细胞分化为功能性神经细胞。
该系列研究工作进一步拓展了光遗传学工具箱，为哺乳动物细胞治疗，细胞基因组的精密时空表观遗传调控、基因调控的基础理论研究和转化应用研究奠定了基础，进一步促进了基于光遗传学的精准治疗和临床转化研究。
通讯作者剪简介
叶海峰，华东师范大学研究员、博士生导师。2007–2013年于瑞士苏黎世联邦理工学院 (ETH Zurich) 从事博士和博士后研究工作。2013年被授予 ETH Zurich 最高荣誉奖章：“ETH Silver Medal”。现担任国家重点研发计划合成生物学重点专项1项、国家创新人才推进计划“中青年科技领军人才”入选者，国家“青千”和“优青”获得者。主要从事合成生物学与生物医学工程领域的研究。主要研究内容为光遗传学与疾病治疗、代谢疾病智能诊疗器件、肿瘤免疫治疗智能诊疗器件、合成生物学与再生医学。相关研究成果以第一或通讯作者身份发表在 Science、Sci Transl Med (2 篇封面)、Sci Adv、Nat Biomed Eng、Proc Natl Acad Sci USA (2 篇) 等期刊。申请发明专利 11 项。担任中国生物工程学会合成生物学专业委员会委员、中国生物工程学会青年工作委员会委员、上海市生物工程学会第七届理事会理事、上海市生物工程学会合成生物学专业委员会副主任委员。中国医药生物技术协会合成生物技术分会委员。