新型光遗传学调控系统，可用于植物中的基因表达调控

来源：BioArt植物

光遗传学（Optogenetics）是指以光为调控介质，光响应元件为受体来调控细胞发育过程的遗传学方法。相比于化学试剂诱导调控，光遗传学手段对于细胞信号转导、代谢过程的调控更有时空特异性并且更容易定量和可逆。遗传编码的光响应元件在哺乳动物研究中广泛应用，比如调节神经传递，基因表达，表观遗传，蛋白活性及亚细胞定位等【1】。相比于动物中的研究，光遗传学在植物研究中的应用滞后很多，一个主要原因在于植物的正常生长需要具有广泛光谱的自然环境白光，白光里的成分会诱导光响应元件错误的激活，从而影响对于光响应元件精准及定量的调控【2】。

为了避免环境光源对于光响应元件的错误激活，德国杜塞尔多夫大学Matias D. Zurbriggen教授团队，研发出一套新型光遗传学调控系统，该系统只有在单一的红光下才激活，而在白光、蓝光及黑暗条件下均处于关闭状态，该系统不仅可以在原生质体及叶片中瞬时调控基因表达，还能以稳定遗传的方式在整个植株中起作用。相关研究以Optogenetic control of gene expression in plants in the presence of ambient white light为题发表于期刊Nature Methods 上。

研究者将其开发的光遗传学系统命名为plant usable light-switch elements (PULSE)，PULSE有两个光响应子系统，一个是蓝光抑制基因表达组件，简称Boff；另一个是红光激活基因表达组件，简称Ron. Boff包含来自于细菌Erythrobacter litoralis的蓝光受体EL222，蓝光照射下EL222组成活性二聚体并结合DNA序列C120【3】，并且EL222上融合了一段转录抑制结构域SRDX. Ron则包含PhyB-VP16和E-PIF6，融合蛋白E-PIF6通过DNA结构域E结合DNA etr元件，红光照射下，红光受体PhyB-VP16通过PhyB与PIF6结合，而转录激活结构域VP16可以招募转录起始复合物来起始转录【4】。除了两个光响应子系统Ron和Boff， PULSE还含有一个人工合成的启动子POpto， POpto由Boff和Ron所能结合的(C120)5 和 (etr)8元件，人巨细胞病毒启动子hCMV及其所驱动的目标基因组成。当只存在红光时Ron激活Boff失活，Ron结合POpto诱导目的基因转录，而当存在蓝光或者多种光谱构成的白光时Ron和Boff都被激活，二者都结合到POpto，净结果是目的基因无法诱导。而在黑暗及远红光时，Ron和Boff均失活，目的基因也无法表达。

图1：光遗传学调控系统PULSE在不同光照条件下的状态模型.

研究者首先在拟南芥原生质体中验证了PULSE的可行性，当只把Ron及POpto转入拟南芥原生质体时，可以观察到在红光、蓝光、白光照射下报告基因均被诱导，这与前人报道的紫外和蓝光可以激活PhyB的结论相一致【5】。而当Ron和Boff及POpto一同转入拟南芥原生质体时，只有在红光条件下，报告基因才被显著诱导，达到黑暗条件下表达量的396.5倍。研究者还开发了一个定量的模型来描述和预测PULSE活性，从而对其更加准确有效的利用。

为了实现PULSE对特定基因表达量的诱导，研究者设计了两种方法，一是利用PULSE诱导核酸酶失活同时偶联了转录激活结构域的Cas9蛋白（dCas9-TV），二是利用PULSE诱导特定的內源转录因子，dCas9-TV和內源转录因子可以进一步激活下游靶基因。结果表明，在拟南芥原生质体中这两种方法均实现了对于下游靶基因的激活。

接着研究者利用农杆菌转化法将PULSE转入烟草叶片中，使PULSE在植物体内瞬时发挥功能，实现了植物在体的诱导靶基因的表达。当感染病原菌时，拟南芥EF-Tu受体EFR会识别细菌分泌的小肽elf18，促进活性氧ROS的产生，帮助植物对病原菌的抵御【6】，而烟草中缺乏EFR受体，无法识别elf18。研究者利用PULSE诱导EFR-GFP在烟草叶片中表达，并且当外源添加elf18后ROS的产量迅速增加，因此增强了对于病原菌的免疫能力。

研究者还检验了PULSE诱导纳米抗体（nanobodies），追踪受体蛋白定位的可行性。首先在烟草叶片中组成型表达融合蛋白EFR-GFP，然后用PULSE诱导 anti-GFP纳米抗体与mCherry的融合蛋白(GFP-binding protein (GBP-mCherry)). 当烟草叶片中不含有EFR-GFP时，mCherry信号存在于细胞质中，而当存在EFR-GFP时GBP与GFP结合，mCherry信号完全位于细胞膜上与GFP信号融合，表明成功地应用PULSE诱导的纳米抗体靶定到了细胞膜受体蛋白。研究者进一步将PULSE系统稳定转化到了拟南芥中，在T3代植株中，挑选两个独立株系检测PULSE对报告基因的诱导，在红光照射下报告基因表达量提高了10到21倍，并且这种诱导是可逆可控的，表明PULSE可以在整个植株中稳定的发挥作用。

图2：PULSE在拟南芥植株中的基因调控功能

综上所述，该研究成功开发了对于环境白光不敏感的光遗传调控系统，该系统可在原生质体，叶片，整株植物中发挥作用，利用该系统可以激活基因表达，增强植物免疫力，追踪蛋白定位等等，为精确可逆的调控植物信号转导，细胞代谢等过程提供了强有利的生物化学工具。