黄龙文等开发全脑尺度长距离连接组绘制技术——BRICseq ​

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现代神经科学的一个重要问题是如何在网络的层次上系统并且定量地测量大脑的结构和活动，并在其基础上建立解释大脑的功能机制的理论。大脑的基因表达组图谱，连接组图谱，和脑活动图谱构成了描述和研究大脑功能的重要数据。而大脑的基因表达、脑回路连接和神经活性之间如何互相影响并决定动物的行为也成为了神经科学最核心的问题之一。过去十年间生物科学包括神经科学的技术的进步，使得全脑尺度高通量、系统性地测量基因表达（如原位测序技术【1,2】，空间转录组技术【3-5】等）和神经活动（如全脑功能超声成像技术【6,7】，广域全皮层/多脑区钙成像技术【8-10】等）成为了可能。

然而快速而准确地在全脑尺度上测量大脑的长距离连接组却仍然是一个挑战。传统测量脑长距离连接组图谱的方法通常依赖于在单个脑区注射顺行或逆行示踪剂，并利用显微成像的技术来绘制该脑区的输入或输出。由于示踪剂可以使用的颜色有限， 通常一只动物仅可进行一次（或少数次）示踪剂注射实验来研究某一个（或少数个）脑区。而为了绘制全脑长距离连接组谱，研究者就需要对不同的脑区分别进行实验，并最终对大量的单个实验进行汇总。尽管近年来研究者已经在这些实验的标准化上有了巨大的进步（例如南加州大学的 iconnectome项目【11】和Allen Institute的Mouse brain connectome 项目【12】），但总体来说全脑尺度的连接组绘制仍然是耗时耗力且昂贵的项目。因而目前仅有少数的模式动物的连接组得到了系统性的绘制，并且在这些模式动物中，通常也仅有一个性别、年龄和遗传背景的动物的连接组是可用的。

2020年7月2日，冷泉港实验室Anthony Zador 等研究组在Cell杂志上发表文章BRICseq bridges brain-wide interregional connectivity to neural activity and gene expression in single animals，报道了BRICseq（Brain-wide individual-animal connectome sequencing）技术，利用DNA条形码（DNA barcodes）和高通量测序技术来解决全脑尺度长距离连接组绘制问题。BRICseq技术基于Zador实验室之前报道的MAPseq  （Multiplexed analysis of projections by sequencing）技术【13-15】，并在其基础上进行了改进且极大地扩增了其应用尺度。该技术的关键在于使用大量独特且多样的核酸条形码来标记并追踪单个神经元的长距离投射。相比于传统技术中可被使用并准确检测的颜色数目的局限性，核酸分子不仅仅具有理论上无穷的多样性，并且可以被高通量、高可靠性的测序技术而检测，从而极大的提高了长距离连接组的测绘通量。

在BRICseq技术中，研究人员首先对辛德毕斯病毒进行了改造，使得它不仅仅可以携带大量多样且独特的核酸条形码，还可以将感染神经细胞后扩增产生的条形码分子定位到神经元的轴突末端。因此，如果在数个脑区同时检测到同一个核酸条形码，那么就意味着某个神经元的胞体和轴突分布在这些不同的脑区中。另一方面，研究人员观察到当病毒感染神经细胞后，扩增后的RNA分子在胞体处的丰度远远高于轴突的丰度，从而为区分包含神经元胞体和轴突的脑区和提供了依据，这将有利于绘制来自于不同脑区的神经元的投射。基于此，研究人员将携带核酸条形码的辛德毕斯病毒注射入小鼠的整个右侧大脑半球（为了涵盖整个半球，一共进行了100多次注射，且这些注射位点呈现500微米间距网格式分布），在等待44 小时的病毒表达后，将整个大脑切为300微米的冠状脑片，并使用激光捕获显微切割技术继续将整个大脑分割为200-300个小块（其中皮层的小块每个弧长约1毫米，另外还包含一些皮层下小块）。最后，研究者利用分子生物学手段和高通量测序技术将这些大脑小块中的核酸条形码进行了测序和分析。

在报道中，研究人员利用BRICseq技术共测量了6只小鼠的全脑长距离连接组。平均在每只小鼠中，从分布于右侧皮层的约100个源小块的 6万个神经元到约250个目的小块的单细胞投射模式得到了重绘。为了量化不同小块之间的投射强度，从源小块A到目的小块B的投射被计算为所有胞体位于A小块的神经元在B小块检测到的核酸条形码的丰度总和除以位于A小块的神经元总数。通过比较这些老鼠之间皮层间长距离连接图谱的相似性，研究人员发现BRICseq具有高度可重复性。通过与Allen Connectivity Atlas的结果进行比较，研究人员发现BRICseq的数据和Allen Connectivity Atlas也具有较好的一致性，证明了BRICseq是有一种可靠且高效的测量长距离连接组的手段。

研究人员还利用BRICseq所测量的皮层连接组数据，对大脑回路的基因表达-神经活动-连接模式的相互关系这一重要问题进行了探索。结合在行为动物中进行广域全皮层钙成像所收集到的神经活动的数据，研究发现皮层之间解剖学上互相连接的强度可以非常好的预测皮层之间功能性连接的强度（即皮层之间神经活动的相关性）。结合来自于Allen 原位杂交数据库中全脑基因表达组的数据，研究者发现皮层之间的长距离连接模式可以很好地被少量标记基因的表达预测，从而推断出皮层间长距离连接模式可能产生于低维度的遗传程序。这些发现意味着大脑的基因表达、连接模式和神经活动间可能存在简单而直接的关联。

基于BRICseq快速和高通量的优势，这项技术可以被用于大脑连接组谱的系统性比较学研究中。作为原理证明性的实验，研究者利用BRICseq测量并分析了BTBR小鼠品系的连接组谱。实验结果重现了BTBR品系中的大脑连接缺陷：胼胝体缺失、皮层的左右两半球之间缺少连接。研究者希望在今后，BRICseq技术可以被用来检测和筛选神经系统疾病动物模型中的大脑连接缺陷，以及比较在不同的物种之间大脑连接模式的差异，从而促进对进化过程以及疾病模型中大脑功能的机理性研究。

相比于传统的绘制长距离连接组的技术，BRICseq拥有高效、价格低、快速等优势：目前单个研究人员可以在4周之内完成一次BRICseq的实验，总花费也在10000美元以内。同时，由于BRICseq可以仅仅使用一只实验动物便绘制出全脑尺度的长距离连接组，这在某些动物资源较为珍贵的模式动物（例如非人类灵长类动物）的研究领域将有很大优势。此外，BRICseq与其它全脑尺度测量基因表达组、大脑活动的实验技术和行为学实验的结合，将使得实验者对单个动物个体的基因表达、连接模式、神经活动和行为特点进行系统性和整合性的研究，从而深入对大脑的结构和功能的科学原理的探索。

该研究由冷泉港实验室的Anthony Zador 和Anne Churchland等研究组的科研人员合作完成，黄龙文博士与Justus Kebschull博士为第一作者。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.029