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新陈代谢是机体生命活动的基本特征。代谢机理研究是生理学中不可或缺的一部分，有助于加深对机体生长发育、内稳态以及对外界刺激相应的认知。此外，异常的代谢表达还与一系列疾病密切相关，包括神经退行性疾病、糖尿病以及癌症等【1-3】。因此，代谢研究在生理学和疾病学中都具有重要意义。然而，相关的代谢成像工具的发展却相对落后。核磁共振和正电子放射断层扫描技术的分辨率不足，难以获取细胞水平的代谢信息。荧光成像具有合适的分辨率，但成像所需的荧光基团体积太大，标记后容易对小尺寸代谢分子的生理活动产生干扰。质谱成像灵敏度高且信息量大，但其原理具有破坏性且成像所需时间较长。拉曼成像，特别是与拉曼振动探针耦合的受激拉曼散射成像技术，近几年来在代谢成像领域中受到了较多关注【4-7】。由于基于化学键的振动探针尺寸较小（如炔基等），用其标记代谢物后所造成的干扰很微弱，因而振动探针很适宜于研究代谢产物在生物体系中的分布。然而，拉曼的散射截面非常小，使得其成像速度较慢（自发拉曼技术）或者光谱范围受限（相干拉曼技术）。这制约了拉曼在代谢成像上的进一步发展。
值得注意的是，作为另一种振动成像技术，红外成像在代谢成像上具有很大潜力。首先，红外吸收截面通常比拉曼散射截面高出十个数量级。其次，量子级联激光器和焦平面阵列检测器的发展与推广使得红外成像具有高通量的优势。然而，现阶段的红外成像却主要采用非标记（label-free）的成像模式，即仅测量生物分子本身的红外振动吸收而鲜少引入探针。因此，系统性地研究红外响应振动探针并将其与红外显微镜相结合将有助于推动传统红外成像在代谢成像领域中的应用，使其成为一种新型的高通量的代谢成像技术。
2020年6月29日，哥伦比亚大学闵玮课题组Nature Methods上发表了题为”Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes” 的论文，借助红外成像高通量的优势，系统性地研究并设计了一系列红外振动探针，首次实现了基于红外成像技术的单细胞代谢异质性分析和大尺度组织代谢成像。
研究人员设计了三种不同类别的振动探针，分别为叠氮键，13C同位素修饰的羰基和氘代探针，来反映细胞、微生物以及小鼠组织中的多种代谢活动。叠氮键是较理想红外振动探针。叠氮基团红外吸收截面大，且在细胞红外光谱沉默区（1800-2700 cm-1）有较强的单吸收峰（2098 cm-1），可实现高信噪比的量化分析。文章中报道了两种使用叠氮键标记的代谢物，甲硫氨酸叠氮衍生物（AHA）和含有叠氮基的棕榈酸，可分别用于反映生物体系如细胞和秀丽线虫中的新生成的蛋白和脂质的代谢分布（图1a-e）。另一种探针为13C同位素修饰的羰基。羰基是生物分子中最强的红外振动模式；且同位素的引入使得原有的羰基产生30到40波数的位移，因而可用于反映生物体系的代谢活动。研究人员引入了13C修饰的氨基酸和葡萄糖两种代谢物来分别表达细胞中蛋白的代谢和脂质的从头合成（图1f-h）。第三种探针是氘代标记物，包括氘代的氨基酸、葡萄糖和重水。此类探针的红外吸收同样位于细胞沉默区，且较经济适用，除细胞外还可用于表达组织和生物膜的代谢活动 (图1i-o)。
图1. 三种红外振动探针借助红外成像高通量的特点，研究人员进一步将开发的振动探针应用至单细胞水平的代谢异质性分析和大尺度组织代谢成像中。乳腺癌是一种较复杂的疾病，且拥有多种细胞亚型。其中三阴性乳腺癌细胞最易转移且最难治愈。为了探究乳腺癌细胞侵略性与代谢活动的关系，三种不同的乳腺癌细胞，分别为MCF-7（非侵略性），MDA-MB-468 (中等侵略性)和MDA-MB-231（高度侵略性），被选定为研究对象。两种不同类别的振动探针，含叠氮基的棕榈酸和氘代的氨基酸，被分别用于反映细胞中的蛋白合成和脂质摄取速率。在对超过2000个细胞进行成像分析后，研究人员绘制了基于两种代谢活动的二维散点图 （图2a）。三种亚型产生了三个清晰可辨的群聚，体现了这些细胞亚型在代谢活动上的显著性差异。此外，散点图还揭示出如下规律，即乳腺癌细胞亚型的侵略性或转移性越高，其蛋白合成和脂质摄取速率均越高。另外，与其它两种亚型相比，具有高度侵略性和转移性的MDA-MB-231细胞在蛋白合成上体现出明显的异质性。除了细胞亚型代谢活动的分析，红外探针还可用于研究化疗药物对细胞代谢的影响。借助于含13C的氨基酸探针和基于量子级联激光器的离散频率红外显微镜 （DFIR），研究人员分析了在化疗药物紫杉醇的作用下上万个细胞在蛋白合成上的代谢变化。由于DFIR比传统傅里叶变换红外显微镜（FTIR）成像速度更快且视野更大，上万个细胞的光谱数据可在两分钟左右采集完成。研究发现在50nM紫杉醇的影响下，乳腺癌细胞的蛋白合成受到了明显的抑制，并且蛋白合成的不均一性相比于对照组显著提升（图2b）。除细胞外，红外振动探针还可应用于组织代谢成像。通过给含有恶性胶质瘤的小鼠在不同阶段饲喂25%的重水并采集相对应的红外光谱数据，组织中的蛋白和脂质合成信息可通过对重水光谱信号的线性分解所得。研究发现早期阶段，从肿瘤中心位置过渡到周围正常脑组织，蛋白和脂质合成都呈现阶梯式的下降；并且随着肿瘤体积的增大，肿瘤和周围组织的代谢上的差异越来越小(图2c)。这些观察证实了在致癌作用中组织中异常的脂质生成和蛋白合成的出现。
图2. 红外振动探针应用于单细胞代谢异质性分析和大规模组织代谢成像非标记成像模式（label-free imaging）一直是红外成像技术中的主流。本文将红外振动探针与红外显微镜相结合，有效推动了红外成像在代谢成像领域中的应用。值得注意的是，文章中报道的三种振动探针实际上是互补的。这三种探针的红外光谱可彼此区分，使得多通路红外代谢成像成为可能。并且有些探针仅针对特定的代谢物，如叠氮探针标记的甲硫氨酸和棕榈酸；有些探针则反映整体代谢的改变，如13C修饰的氨基酸和葡萄糖。两者的结合有助于更完整地表达生物体系的新陈代谢的改变。技术方面，尽管受光源波长的影响，红外成像的空间分辨率（约3微米）与拉曼成像相比有所不足，但其涵盖光谱范围更宽且成像速度更快，因而很适宜于空间分辨率影响较小的大尺度应用，如单细胞水平代谢分析和组织成像等。此外，文章中报道的红外探针还可直接应用到其它空间分辨率更高的红外成像技术中，如光热红外成像、光声红外成像和原子力显微镜红外成像（AFM-IR）等，以探究亚细胞水平的代谢分布。可以预见的是，红外振动探针在代谢成像上具有较大潜力，并且将会被更广泛地应用至多种红外成像技术中。
参考文献
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