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生物体通过编码20种天然氨基酸执行各种复杂的生理功能。遗传密码拓展系统能够将非天然氨基酸位点特异性地引入到蛋白质上，用于蛋白质功能的研究和设计全新的蛋白质功能。该技术已经应用于蛋白质的示踪【1, 2】，抗体药物偶联物的合成【3, 4】，蛋白质翻译后修饰功能的解码【5, 6】，蛋白质功能的化学操纵【7-9】，新型生物酶的智造【10】等领域。遗传密码拓展系统的核心是使用具有正交性的氨酰tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，用于非天然氨基酸的识别。在这一研究方向上，部分古菌中的吡咯赖氨酸aaRS/tRNA对因其具有广谱正交性和较好的催化活性是目前同时适用于原核生物和真核生物的理想系统。该系统的发现显著推动了遗传密码拓展系统的应用，遗憾的是自然界中仅有这一类具有广谱正交性的系统，限制了引入非天然氨基酸的种类和效率。2020年6月22日，浙江大学生命科学研究院林世贤实验室在Nature Communications在线发表题为Chimeric design of Pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs and canonical synthetase/tRNA pairs for genetic code expansion的研究论文。该研究开发了4种在原核生物和真核生物都具有正交性（广谱正交性）的嵌合体aaRS/tRNA对，并利用嵌合体苯丙氨酸系统引入翻译后修饰和荧光活性非天然氨基酸。
该论文发明了一种基于嵌合体设计的蛋白质工程改造新方法。通过嫁接吡咯赖氨酸aaRS/tRNA对的正交元件到天然aaRS/tRNA对上，将后者改造成为具有广谱正交性的系统。（图1）吡咯赖氨酸aaRS/tRNA对因其独特的识别分子机制实现了广谱正交性。首先，吡咯赖氨酸tRNA的结构特殊，与典型tRNA结构不同，具体表现为短的可变区、非典型D-loop和小T-loop；其次，吡咯赖氨酸aaRS的tRNA结合结构域折叠成天然aaRS中不存在的球状结构，特异性地识别吡咯赖氨酸tRNA的独特结构元件；最后，不同于典型的aaRS/tRNA对，吡咯赖氨酸aaRS不识别tRNA的反密码子环。在深入的理解了吡咯赖氨酸 aaRS/tRNA广谱正交性原理的基础上，研究人员提出嵌合设计策略-将吡咯赖氨酸aaRS/tRNA对中的独特的正交结构元件直接嫁接到天然氨基酸aaRS/tRNA对上，从而实现天然氨基酸aaRS/tRNA对的正交化。（图1）通过对PDB数据库中天然氨基酸aaRS/tRNA三维结构的分析，研究者设计并构建了17种嵌合aaRS/tRNA对。然后利用绿色荧光蛋白琥珀密码子插入实验对嵌合体活性进行测试，得到了8对有活性的嵌合体。进一步优化嵌合设计和表达调控元件，结合tRNA的工程进化，最终开发出了4个活性较高且具有广谱正交性的嵌合aaRS/tRNA对，分别为：嵌合体组氨酸系统、嵌合体苯丙氨酸系统、嵌合体丝氨酸系统和嵌合体丙氨酸系统。
图1. 嵌合体设计思路。研究者进一步探索了嵌合正交对识别非天然氨基酸的可行性。通过分析嵌合体苯丙氨酸系统aaRS的底物结合口袋，设计了突变文库，经过正负筛选策略得到一系列嵌合苯丙氨酸aaRS突变体。这些突变体能够在原核细胞和真核细胞将多种苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸类似物位点特异性地引入到蛋白质中。这些非天然氨基酸包含了首次被引入到真核生物中的翻译后修饰L-Dopa，可用于蛋白质双光子成像示踪的、具有荧光特性的氰基色氨酸等。
开发新型正交遗传密码扩展系统是领域的研究难点。该论文证明aaRS/tRNA对的正交性具有可嫁接性，并发现嫁接了广谱正交元件的天然氨基酸aaRS/tRNA对具有广谱正交性、较好的催化活性和识别口袋可改造性。嵌合体设计原理具有普遍适用性，有望将更多天然aaRS/tRNA对正交化。有意思的是，近日英国医学研究理事会的Jason chin实验室连续在Nature Biotechnology 【11】和Nature Chemistry 【12】上发文探讨新型遗传密码拓展系统的正交性和交互正交性。在Nature Biotechnology论文中，Jason chin团队通过计算筛选方法，开发在大肠肝菌中正交的新型aaRS/tRNA对。其开发的技术能够快速确定tRNA在大肠杆菌内的正交性。论文中作者测试了243个tRNAs，最后鉴定出5对在大肠杆菌中正交的aaRS/tRNA对，同时测定了8对aaRS/tRNA具有交互正交性。
总体来说，新型正交系统的开发将推动非天然氨基酸引入的种类、效率及其在生物学和医药开发研究中的应用。特别是嵌合体翻译系统在原核生物和真核生物都具有良好的正交性，有效地扩展了广谱正交系统的种类，展示出了良好的应用前景。
据悉，博士后丁文龙和博士生赵红霞是论文的共同第一作者。
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