基于type I-F CRISPR-Cas的转录激活工具

来源：BioArt

通过将转录激活因子与CRSIPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins）系统的效应蛋白融合，研究人员已经开发了一系列转录激活工具【1-5】。利用这些转录激活工具可以在不改变基因组DNA的情况下，直接激活细胞内源基因的表达，有望治疗一些由于内源基因表达不足导致的遗传疾病，并避免基因编辑导致的DNA脱靶等副作用。例如，激活HBG基因的表达可以治疗HBB基因突变导致的β-地中海贫血。但是，现有转录激活工具激活内源基因表达的效率仍然不高，如何提高转录激活的效率成为亟待解决的科学问题。

近日，中山大学生命科学学院的松阳洲教授课题组在Nature Communications发表题为Repurposing Type I-F CRISPR-Cas System as a Transcriptional Activation Tool in Human Cells的文章，首次把type I-F CRSIPR-Cas系统Cascade复合物的Csy3亚基与VPR（VP64-p65-Rta）融合, 证明type I-F CRISPR-Cas系统可以高效激活哺乳动物细胞内源基因的表达。

与只含有一个效应蛋白的Class 2 CRISPR-Cas系统不同（如Cas9, Cas12a等），Pseudomonas aeruginosa type I-F CRISPR-Cas系统的Cascade复合物（PaeCascade）包含了4个效应蛋白，其中，Csy3亚基有6个拷贝，将VPR与Csy3亚基融合可能可以提高基因的转录激活效率。为此，作者把 PaeCascade复合物中的4个亚基（Csy1, Csy2, Csy3和Csy4）分别与VPR融合表达，发现将Csy3与VPR融合表达时（PaeCascade-VPR），其激活外源GFP基因表达的效率最高（图1）。

 图1

随后，作者利用PaeCascade-VPR激活细胞内源基因（如HBB，HBG等），并与现有的CRISPR-Cas转录激活系统（dCas9-VPR, dAsCas12a-VPR, EcoCascade-VPR）进行了对比，发现在多个位点PaeCascade-VPR的转录激活效率都是最高的（图2 b-e）。

图2

为了进一步提高PaeCascade-VPR的转录激活效率，作者尝试延长crRNA的间隔序列，从而增加 Cascade复合物中Csy3的拷贝数，发现PaeCascade-VPR的激活效率随着crRNA间隔序列的延长有明显提高（图3）。

图3

最后，作者比较了PaeCascade-VPR和dCas9-VPR系统的脱靶效应, 发现在多个潜在的脱靶位点均未检测到PaeCascade-VPR对脱靶基因的转录激活，说明PaeCascade-VPR的特异性高（图4）。

图4

总体而言，该工作开发了以type I-F CRISPR-Cas系统为基础的哺乳动物高效转录激活工具，为哺乳动物细胞的基因表达调节提供了新的工具。该系统通过将Cascade的Csy3亚基与VPR融合，提高了CRISPR-Cas转录激活系统激活内源基因表达的效率，且其激活效率还可以通过延长crRNA的间隔序列从而进一步提升。该研究弥补了现有CRISPR-Cas转录激活系统对某些基因位点激活效率低的不足，有望用于治疗内源基因表达不足导致的遗传疾病。

据悉，松阳洲教授课题组博士后陈昱僖和2018级博士生刘嘉琪为共同第一作者，松阳洲教授和梁普平副教授为共同通讯作者。