Nature｜破解致癌代谢物促进肿瘤化疗敏感性之谜

来源：BioArt

代谢失调与基因组的不稳定性是肿瘤细胞的两大特征。之前的研究工作已经揭示由代谢酶突变引起的致癌代谢物 (Oncometabolite) 的累积是肿瘤发生的一个重要驱动因子，例如， 由IDH1/IDH2突变产生的2-HG【1】以及FH突变和SDH突变引起的fumarate（延胡索酸）和succinate（琥珀酸）的累积【2，3】。而最近的一项研究则指出：这些Oncometabolite会抑制同源重组依赖的DNA损伤修复 (Homology-dependent repair, HDR)，并通过合成致死效应增强携带这些代谢酶突变的肿瘤细胞对于PARP抑制剂的敏感性【4】。然而，其中的分子机制却并不清楚。

2020年6月3日，来自耶鲁大学医学院放射治疗系Peter M. Glazer和Ranjit S. Bindra研究团队在Nature 上发表了题为Oncometabolites suppress DNA repair by disrupting local chromatin signalling的研究，找到了致癌代谢物抑制同源重组依赖的DNA损伤修复的分子机制：通过抑制去甲基化酶KDM4B的活性，导致H3K9甲基化水平的异常升高，从而阻碍了由H3K9me3信号驱动的同源重组依赖的DNA损伤修复。

2017年，该研究团队在Science Translational Medicine 上首次报道了IDH1/IDH2突变产生的2-HG可以通过抑制HDR通路进而提高PAPR抑制剂对于这类肿瘤的杀伤效果，并筛选到两个潜在的作用靶点蛋白—组蛋白赖氨酸的去甲基化酶KDM4A和KDM4B。但是，当时它们并不清楚2-HG是否是通过这两个去甲基化酶来抑制HDR通路。因此，在这项研究中，作者试图找到这一问题的答案。

作者首先考虑到，这些oncometabolites是否通过表观遗传下调了HDR通路蛋白的基因表达？但结果表明，IDH R132H突变或者敲低FH和SDH并不会改变HDR通路中RAD51,BRCA2, ATM, TIP60, MRE11及RPA的蛋白水平。因此，作者把研究的焦点转向了HDR的功能。当出现DNA双链断裂 (DSB) 时，RAD51等这些效应蛋白会很快被招募到损伤位点而形成foci，作者发现在细胞中引入IDH R132H突变或者敲低FH和SDH会减少由电离辐射导致的RAD51和BRCA1 foci的形成,且IDH突变的肿瘤细胞对于放疗更加敏感。这说明由IDH,FH,SDH突变产生的2HG,fumarate和succinate可以直接抑制了HDR的功能，而不是在表观层面降低了相关修复蛋白的基因表达。

为了更进一步搞清楚这些oncometabolites的作用机制，作者构建了一套DSB-CHIP的报告系统去监测当DNA特定位点出现DSB，HDR通路的效应蛋白被招募到损伤位点的动力学过程。结果显示，对照组细胞在DSB产生的30min之内，损伤标志物γ-H2X会迅速累积紧接着会很快消失，说明DNA损伤被及时修复。而2-HG，fumarate和succinate预处理的细胞γ-H2X信号则会持续存在一段时间，说明细胞对于DSB修复能力减弱。另外，作者在对照组细胞的损伤位点观测到H3K9me3水平在很短时间内会突然升高但在1hr之后消失，并依次伴随着其他效应蛋白MRE11，TIP60，ATM，RPA,BRCA1和RAD51的出现。然而，2-HG，fumarate和succinate预处理的细胞在时间零点就已经处于高H3K9me3水平状态，同时HDR通路效应蛋白也不会被招募到DSB位点。这说明，由这些oncometabolites导致的H3K9me3水平异常升高可能阻碍了后续HDR通路蛋白的修复过程，而这一结论也在检测了其他细胞表型以及设计一系列rescue实验（包括外源添加α-KG，过表达KDM4A和KDM4B等）之后得到了进一步的证明。

为了验证2-HG，fumarate和succinate的确是通过抑制了KDM4A和KDM4B活性进而导致了H3K9me3水平的异常升高。作者构建了KDM4A和KDM4B敲除的细胞系，结果显示只有敲除KDM4B才会导致HDR缺陷，并会导致H3K9me3水平的异常升高，这与之前2-HG，fumarate和succinate处理细胞的效果是一致的，而敲除KDM4A则没有效果。这说明，这些oncometabolites主要是通过抑制KDM4B活性导致了H3K9me3水平的异常升高。

那么接下来要回答的问题是：由oncometabolites导致的H3K9me3水平异常升高是如何抑制了HDR通路？作者提出了这样一个猜想：oncometabolites引起的持续高H3K9me3水平可能掩盖了细胞本身在双链损伤发生时H3K9me3的信号，进而阻碍了后续HDR通路效应蛋白的招募。之前的研究表明，H3K9M突变体可以充当“诱饵”去捕获细胞中的甲基转移酶从而降低H3K9me3的形成【5】。于是，作者在细胞中过表达了H3K9M，发现的确可以降低oncometabolites所致的 H3K9me3水平异常升高并能回复HDR通路对于DNA双链损伤的修复能力，而过表达其他类型的突变体 (H3K9G, H3K9Q, H3K9R) 以及其他位点的突变体 (H3K4, H3K27 and H3K36) 则没有效果。更为重要的是，作者观察到过表达H3K9M会使得在2HG处理下，细胞内H3K9me3信号在DSB产生之后先迅速上升然后消失，这与对照组中所观察到的实验现象是一样的，说明作者的猜想是正确的。

最后，总结一下：该研究团队的这项工作实际上是在之前发现的基础上对机制部分进行了完善。更有意义的地方在于，这一发现是继成功利用PARP抑制剂治疗BRCA突变的乳腺癌和卵巢癌之后，有希望再次借助“合成致死”效应去治疗携带IDH1/2，FH和SDH突变的恶性肿瘤，相关研究目前已经进行到临床试验阶段。

参考文献

1. Dang, L. et al. Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature 462, 739–744 (2009).

2. Toro, J. R. et al. Mutations in the fumarate hydratase gene cause hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer in families in North America. Am. J. Hum. Genet. 73, 95–106 (2003).

3. Pollard, P. J. et al. Accumulation of Krebs cycle intermediates and over-expression of HIF1α in tumours which result from germline FH and SDH mutations. Hum. Mol. Genet. 14, 2231–2239 (2005).

4. Sulkowski, P. L. et al. 2-Hydroxyglutarate produced by neomorphic IDH mutations suppresses homologous recombination and induces PARP inhibitor sensitivity. Sci. Transl. Med. 9, eaal2463 (2017).

5. Xu, Y. et al. Targeted disruption of ATM leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10, 2411–2422 (1996).