Cell | 中枢神经系统水肿如何“治本”——靶向水通道蛋白AQP4的膜定位

来源：BioArt

撰文 | 胡小话

责编 | 兮

脑水肿和脊髓水肿通常统称为中枢神经系统水肿（CNS edema），主要是由外伤、感染、肿瘤生长以及血液供应障碍引起，每年影响数百万人。细胞毒性水肿（Cytotoxic edema）和血管源性水肿（Vasogenic edema）是导致CNS edema形成的两个重要原因。细胞毒性水肿是指细胞中的水过量累积。例如，缺氧会导致能量依赖的溶质稳态被打破，因此水会顺着渗透梯度流入血管周边的星形胶质细胞，进而导致它们的肿胀。而细胞内水的累积会进一步导致周围环境的渗透压紊乱进而引起离子型水肿（ionic edema），并会破坏血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB），使得水在胞外累积，也被称作血管源性水肿。

水通道蛋白Aquaporins（AQPs）作为细胞膜上的控制水运输的通道蛋白，在细胞毒性水肿的发展过程中扮演重要角色。其中，AQP4是CNS中最重要的一个亚型，并在星形胶质细胞中大量表达【1】。研究人员发现在AQP4-KO的小鼠中，缺血引起的脑水肿相比于对照组降低了35%【2】，这说明AQP4对于治疗CNS edema是一个很有潜力的成药靶点。遗憾的是，尽管经过了多年的努力，直到目前，所有的水通道蛋白的抑制剂都止步于临床试验，这意味着当下唯一的治疗选择只能是去舒缓水肿带来的症状，只能“治标”，不能“治本”。

2020年5月14日，来自英国阿斯顿大学生命与健康科学学院Roslyn M. Bill教授与伯明翰大学医学与牙科学院的Alex C. Conner教授和Zubair Ahmed教授共同合作在Cell上发表了题为Targeting Aquaporin-4 Subcellular Localization to Treat Central Nervous System Edema的研究。在这项研究工作中，他们另辟蹊径——通过靶向AQP4的膜定位，而不是直接抑制AQP4的活性来改善CNS edema，并在脊椎损伤模型的大鼠中取得了成功。

2015年，Alex C. Conner教授团队在HEK293T细胞中证明抑制钙调蛋白CaM和激酶PKA的活性可以减少低渗引起的AQP4在细胞膜上的定位【3】。以往研究表明：控制星形胶质细胞的大小才是避免CNS edema引起损伤的关键。因此，作者首先在星形胶质细胞中去验证AQP4的膜定位在低渗模型和低氧模型中是否发生改变。结果表明，无论是低渗还是低氧处理都会导致AQP4在星形胶质细胞膜上定位的增加，而Ca2+螯合剂（EGTA-AM）、CaM抑制剂（TFP）以及离子通道蛋白TRPV4抑制剂（HC-067047）都能阻止这一现象的发生。为了探究CaM在PKA激活过程中如何发挥作用，作者检测了细胞中cAMP的累积。作者发现cAMP的水平在低渗处理下上升了10倍，而CaM抑制剂则可以完全逆转这一现象。这些实验说明：由Ca2+介导的CaM激活对于PKA的激活是必需的，同时它们的激活对于AQP4在星形胶质细胞膜上的定位十分重要。

为了在体内探究降低AQP4膜定位对于缓解CNS edmema是否有效，作者在脊椎损伤(SCI)的大鼠模型中展开了研究。作者发现CaM抑制剂（TFP）和PKA抑制剂（H89）可以有效抑制脊柱损伤导致脊柱含水量的上升。同时，AQP4细胞膜定位在脊柱损伤的大鼠是升高的，而用TFP和H89处理则会降低AQP4的膜定位，这与之前脊柱含水量的结果是一致的。另外，作者注意到TFP和H89不仅能降低AQP4在BSCB上的膜定位，还能减少AQP4蛋白的表达，进一步的实验则表明这两种抑制剂是通过PKA-AKT-Foxo3a轴来调控AQP4的表达量。以上实验说明：CaM抑制剂（TFP）和PKA抑制剂（H89）可以有效减少AQP4的膜定位以及表达并缓解CNS edmema。

在之前的研究中，作者发现PKA催化的AQP4 S276位点的磷酸化对于AQP4膜定位是必要但非充分条件，这提示CaM除了通过PKA调控AQP4上膜之外还有别的作用途径，例如直接与AQP4进行结合。事实上，CaM也的确报道可以与其他的AQPs蛋白结合【4】。通过与钙调素靶向蛋白数据库（Calmodulin Target Database）进行比对，作者在AQP4的C端上找到一段CaM的结合序列。通过结构预测，该序列的3个苯丙氨酸构成的疏水平面可能是与CaM结合的关键区域。而接下来体外实验证明：全长的AQP4可以与CaM结合，而C端缺失的AQP4 (AQP4-Δ256) 和将苯丙氨酸替换的 (AQP4-F258/262/266A) 的突变体则丧失与CaM结合的能力，这一结论在细胞内的互作实验中得到了进一步的验证。同时，作者在体外证明AQP4与CaM的结合可以被TFP以浓度梯度的方式所拮抗。另外，细胞内的结果表明AQP4-F258/262/266A突变体与AQP4-WT相比，其膜定位所需的时间延长。这些结果说明：CaM与AQP4结合对于AQP4的膜定位是十分重要的。

最后，作者对SCI模型大鼠给药后的电生理和行为学展开验证。结果表明TFP和H89给药处理能显著提升脊柱损伤大鼠的感知和运动能力。另外，给药组大鼠的BSCB破坏程度以及病变腔的大小与对照组大鼠相比也得到了明显的改善。

总而言之：该研究团队首先在机制上阐明了CaM和PKA如何介导了AQP4在星形胶质细胞上的膜定位（见下图）。其次，他们在前期工作的基础上找到了一种已经被批准用于临床的药物—TFP，可以在大鼠模型中有效缓解中枢神经系统水肿，未来有希望应用于临床。尽管TFP作为多巴胺和肾上腺素受体的拮抗剂被广泛用作抗精神抑郁的药物【5】，但作者通过实验排除了TFP是通过它们来发挥作用的。最后，这项工作为也今后中枢神经系统水肿的干预提供了新的思路。

制版人：珂

参考文献

3. Kitchen, P., Day, R.E., Taylor, L.H., Salman, M.M., Bill, R.M., Conner, M.T., and Conner, A.C. (2015). Identification and molecular mechanisms of the rapid tonicity-induced relocalization of the aquaporin 4 channel. J. Biol. Chem. 290, 16873–16881.

4. Rabaud, N.E., Song, L., Wang, Y., Agre, P., Yasui, M., and Carbrey, J.M. (2009). Aquaporin 6 binds calmodulin in a calcium-dependent manner. Biochem. Biophys. Res. Commun. 383, 54–57.

5. Creese, I., Burt, D.R., and Snyder, S.H. (1996). Dopamine receptor binding predicts clinical and pharmacological potencies of antischizophrenic drugs. J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 8, 223–226.