JIPB | 河北科技大学优化新型Cas12b蛋白用于植物的基因组编辑

来源：JIPB

CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中一种抵抗外源核酸物质入侵的获得性免疫防御系统。自该系统被开发成为第三代基因组编辑技术以来，便一直处于生命科学研究的前沿。基于Cas9和Cas12a/Cpf1蛋白的两种编辑系统被广泛的应用于动、植物及微生物的基础研究和实践应用之中。目前，最新开发的Cas12b蛋白形成了第三种CRISPR-Cas基因组编辑系统，该系统与Cas9、Cas12a同属于class 2类系统，Cas12b蛋白（又称C2c1）具有一个保守的RuvC结构域和Nuc结构域，可通过双RNA引导（crRNA和tracrRNA），识别富含AT的PAM序列，在PAM远端进行DNA双链切割，产生5'粘性末端。该蛋白的尺寸小于Cas9和Cas12a，较难容忍向导RNA与靶DNA之间的碱基错配，因此具有较小的脱靶效应，是一个富有潜力的基因组编辑新工具。

JIPB近日在线发表了河北科技大学孔德晶课题组题为“Targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using CRISPR-Cas12b/C2c1”的研究论文。该研究在拟南芥中测试了CRISPR-Cas12b系统以及一种新型的BvCas12b蛋白的基因组编辑能力，在多个基因位点上成功实现了靶位点突变、多位点编辑以及大片段缺失的基因组编辑。结合之前的研究结果，该研究有力证明了CRISPR-Cas12b系统是继Cas9和Cas12a之后，第三种可用于植物的CRISPR基因组编辑工具。

CRISPR-Cas12b系统在拟南芥中的靶位点编辑

该研究首先针对拟南芥的密码子优化Cas12b序列，双端添加NLS序列，从而保证Cas12b蛋白在植物拟南芥细胞核中的表达。随后，选取PDS3、FLS2、GL2 和TT4基因位点进行靶位点突变，以靶向相近位点的Cas9蛋白作为对照。T7E1检测的结果显示，Cas12b蛋白在大部分位点造成了插入/缺失的突变。深度测序结果显示，Cas12b蛋白的编辑效率从0%-4.3%不等，且具有位点效应，编辑形式主要是在切割位点产生5-13 bp的片段缺失。进一步设计采用双靶点的编辑方式，实现了同时对双位点的靶向突变。并且，通过控制双靶点的距离，可以实现1,000 bp左右的大片段缺失突变。于此同时，脱靶效应验证表明该蛋白不能容忍大于3 bp的guide错配。最后，通过稳定转化拟南芥植株，得到了靶基因功能缺失的编辑突变体，证明了CRISPR-Cas12b系统以及新型的BvCas12b蛋白在拟南芥中的基因组编辑能力。

孔德晶课题组主要在植物中开展基因组编辑的研究，该论文验证的新型Cas12b蛋白进一步拓展了CRISPR-Cas12b系统在植物中的应用。河北科技大学硕士生吴凡、乔新宇和赵亚飞为该论文的共同第一作者，孔德晶为通讯作者，首都师范大学刘良玉和中国农科院（深圳）农业基因组所汪泉为共同通讯作者。该研究得到了河北省自然科学基金、河北省一流学科建设基金、河北省教育厅科学技术研究基金及国家自然科学基金的资助。

参考文献

JIPB面向全球，精心选编刊发植物生物学研究领域有创新性的重要研究论文、特邀综述、突破性报道、新资源、新技术和评论性文章。

目前，JIPB已发展成为能够代表中国植物科学发展水平、在国际上具有重要影响的学术期刊。2018年5年SCI影响因子为4.061，在SCI收录的228种植物科学期刊中排名第26名，位居国际该领域期刊的前11%。连续7年位居SCI植物科学领域Q1区，生物学大类1区，植物学小类1区。被PubMed、SCI、Google Scholar、CA、BA和BIOSIS等85个国内外重要检索机构收录。