北大刘涛/李默开发CRISPR非天然氨基酸偶联技术提高基因编辑效率

来源：X一MOL资讯

CRISPR/Cas9技术自报道以来飞速发展，有望开启基因治疗的新时代。利用Cas9对靶基因进行切割，进而通过供体DNA模板介导的同源重组修复机制来实现实现精准基因编辑具有广泛的应用前景，然而在哺乳动物细胞中同源重组修复发生率很低，这大大局限了利用CRISPR进行同源重组治疗性应用的空间。因此如何提高HDR频率从而提高精准基因编辑效率是CRISPR/Cas9在生物医药领域应用中亟待解决的重要问题之一。
近日，北京大学药学院刘涛研究员与北医三院李默研究员团队在Science Advances 发表研究论文。作者利用化学生物学技术来解决这一基因编辑领域的关键问题，利用刘涛课题组发展的非天然氨基酸定点修饰技术，首次实现了重组CRISPR/Cas9蛋白的定点叠氮化学修饰，利用无铜催化的生物正交反应开发了Cas9蛋白与重组供体DNA偶联技术，通过共价或非共价募集供体DNA到切割区域，从而将同源重组的发生时的三分子反应变成了双分子反应，进而有效提高精准基因编辑效率（图1）。

图1. 化学修饰Cas9蛋白与供体ssODN直接或间接偶联提高同源重组策略
通过系统的优化，作者发现利用非共价募集的方法通过碱基互补配对实现供体DNA的富集是一种高效且通用的方法，这样使用者不需要再合成复杂的末端化学修饰的供体DNA，只需要在作者开发的通用型核酸蛋白偶联复合物上加入常规订购的同源重组供体DNA，就可以极大的提高同源重组效率，在细胞水平实现10倍以上的提升（图2）。在此基础上，作者进一步证明基于该技术在小鼠胚胎水平也能够实现高效的基因同源重组的提升，从而实现靶基因的精准插入（图3）。该工作通过将生物正交反应与蛋白质化学应用到解决重大生物技术问题中，体现了化学生物学的学科优势，为基因编辑技术在生物医药领域的应用奠定了技术基础。
有趣的是，在该文投稿的四天后，哈佛&MIT的BROAD研究所的Amit  Choudhary教授团队于2019年8月12号在预印本发表了一篇题为“A conjugation platform for CRISPR-Cas9 allows efficient β-cell engineering”的文章，其策略也是利用蛋白核酸偶联的策略实现供体DNA的富集，只不过采用的是工程化的巯基的方式，可谓是英雄所见略同。北大团队的非天然氨基酸化学修饰的Cas9与其相比对蛋白整体的活性和稳定性影响较小，此外化学修饰Cas9蛋白平台可以与修饰核酸互相补充，具有很大的推广潜力，可广泛应用于构建细胞和动物模型，助力CRISPR/Cas9向生物医药应用的推动。

图2. Cas9蛋白与供体DNA间接偶联提高同源重组效率

图3. 利用Cas9核酸偶联技术在小鼠胚胎水平实现高效精准基因编辑
本文的第一作者是北京大学博士凌鑫宇、博士后解炳腾和博士后高小芹。通讯作者为北京大学药学院的刘涛研究员和北京大学第三医院李默研究员。