揭示革兰氏阴性菌维持外膜不对称性的分子机理

来源：BioArt

细菌感染的耐药性是医学界的重大难题之一。革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌、肠杆菌、鲍曼不动杆菌）是临床常见，也是耐药菌最为集中的一类致病菌，严重威胁着人类的生命健康。究其原因，主要是因为它们特有的选择通透性外膜在允许养分进入的同时能有效屏蔽抗生素药物进入。革兰氏阴性菌外膜选择通透性归结于其内小叶磷脂层和外小叶脂多糖层的非对称性构造，维持细菌外膜非对称性对于革兰氏阴性菌的存活具有重要意义。非对称脂质维持蛋白MlaFEDBCA (Maintenance of lipid asymmetry) 通过回收转运在应激情况下产生的细菌外膜外小叶磷脂来维持外膜非对称性结构，这对于维持革兰氏阴性菌外膜稳定性起到了重要作用，若破坏这一平衡，则能够干扰细菌存活甚至杀灭细菌。因此，探索参与这一途径主要蛋白质机器的具体机制尤为重要，可为新型抗菌药物研发提供基础。 2020年11月16日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室/国家老年疾病临床医学研究中心董浩浩研究员团队、浙江大学医学院张兴教授团队和英国东安格利亚大学医学院董长江教授团队合作在Nature Structural & Molecular Biology上发表题为 “Structural insights into outer membrane asymmetry maintenance in Gram-negative bacteria by MlaFEDB” 的研究论文，全面阐述了多重耐药细菌—革兰氏阴性菌用于转运外膜磷脂成分从而维持外膜不对称性结构的蛋白质机器复合体MlaFEDB的高效能转运机制，为以此蛋白机器为靶点设计新型抗菌药物提供了科学依据。 革兰氏阴性菌内膜ABC转运蛋白复合体MlaFEDB与周质蛋白MlaC及外膜蛋白复合体MlaA/OmpF(C) 形成磷脂转运通道。但磷脂具体的转运方向一直存在争议：目前支持磷脂内转说法的团队报道了MlaFEDB蛋白的敲除影响细菌外膜的稳定性，从而提高药物敏感【1,2】。而支持磷脂外转的团队则是观察到在MlaFEDB蛋白被敲除的情况下，磷脂在内膜上的堆积【3,4】。由于多蛋白参与，且涉及双向跨双膜转运的复杂性目前没有全面且系统的体外转运方法来证实Mla通路转运磷脂的方向。 为深入探究这一争议的科学问题，研究团队首先采用荧光共振能量转移技术 (FRET)，创新性的首次在体外构建了7个蛋白的转运体系，即将内膜蛋白MlaFEDB和外膜蛋白MlaA/OmpF(C) 分别重构入含不同荧光染料(NBD-PE和Rhod-PE) 标记的磷脂中形成蛋白囊泡 (proteoliposome)。由于NBD和Rhod两种荧光染料在一定距离可产生FRET现象，当加入周质蛋白MlaC，蛋白囊泡上标记的磷脂被转移而发生距离的变化，通过检测FRET荧光强度变化间接反映磷脂转移情况 (图1b)。应用该实验体系，结合蛋白点突变技术，研究团队成功证实 MlaFEDB 利用ATP耗能主要以反向转运 (retrograde) 方式进行磷脂转运，即MlaA/OmpF(C) 将外膜外小叶中的磷脂转运给MlaC, 随后MlaFEDB通过ATP水解耗能的方式抽提与MlaC结合的磷脂并将其转运至内膜 (反向转运，retrograde) 以维持外膜的不对称性。但同时团队也发现微弱的正向 (anterograde) 转运信号。为进一步验证 MlaFEDB的转运机制，研究团队以类似的蛋白转运系统，应用薄膜层析技术 (TLC)，将 MlaC分离并鉴定其结合的磷脂。结果表明，MlaFEDB 亦主要以反向转运 (retrograde) 方式进行磷脂转运；有意思的是，内膜磷脂也可经由MlaFEDB采用非能量的扩散方式传递至MlaC，但MlaC结合的磷脂能否被 MlaA/OmpF(C) 复合物转运至外膜目前未能证实。 图1非对称脂质维持蛋白Mla蛋白质机器介导的磷脂转运通路 (a); FRET（Anterograde/ Retrograde）的实验设计示意图 (b). 接着，研究团队以单颗粒冷冻电镜技术，解析了MlaFEDB (apo 状态) 及其与底物磷脂、AMP-PNP和ADP结合状态下的4个高分辨率冷冻电镜结构 (图2a-f)，令人惊讶的是，MlaFEDB的底物结合腔中结合磷脂亲水头的功能位点处于底物结合腔的中间位置，两边的氨基酸均为疏水残基，预示磷脂将有可能以正反两种方式结合，间接表明MlaFEDB可能通过正向 (anterograde) 和反向 (retrograde) 两种方式转运磷脂，与功能研究结果一致。以上研究表明，MlaFEDB蛋白质机器是具有双向转运可能的细菌ABC转运体蛋白。不同的是，外膜磷脂向内转运 (retrograde) 需要依赖ATP能量，而将内膜磷脂向外转运 (anterograde) 则是非能量的扩散现象。不仅如此，该研究还通过大量体内突变实验确定了多个提高细菌药物敏感度的功能位点，这些功能位点可作为新型抗菌药物设计的有效靶点。 图2 MlaFEDB及其结合底物高分辨率冷冻电镜结构综上，该研究首先结合FRET和TLC等技术，首次在体外构建了MlaFEDB-MlaC-MlaA/OmpF(C) 7个蛋白的转运体系，模拟革兰氏阴性菌体内磷脂转运途径，揭示了其转运机制；其次，解析了蛋白复合体MlaFEDB及其与不同底物结合的高分辨冷冻电镜结构，从结构层面上进一步验证了其转运机制；最后，通过体内突变实验，确定了MlaFEDB蛋白复合体的多个功能位点。总之，该研究以体内、外功能实验结合高分辨率冷冻电镜结构，系统地揭示了革兰氏阴性菌维持外膜不对称性的分子机理，对以该蛋白复合体为靶点研发新型抗菌药物具有十分重要的指导意义。 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室副教授唐晓迪博士、浙江大学医学院冷冻电镜中心工程师常圣海博士及四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室博士研究生乔文为该论文的共同第一作者。 

参考文献：1.Malinverni, J. C. & Silhavy, T. J. An ABC transport system that maintains lipid asymmetry in the gram-negative outer membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 8009–8014 (2009).2.Abellón-Ruiz, J. et al. Structural basis for maintenance of bacterial outer membrane lipid asymmetry. Nat. Microbiol. 2, 1616 (2017).3.Kamischke, C. et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife 8, e40171 (2019).4.Hughes, G. W. et al. Evidence for phospholipid export from the bacterial inner membrane by the Mla ABC transport system. Nat. Microbiol. 1 (2019).